Nous tenons à remercier le centre de cytométrie en flux de l’URMC. Ces travaux ont été soutenus par le prix de l’American Society of Hematology, le prix de la Fondation pour la recherche sur la leucémie et les subventions du NIH R01DK133131 et R01CA266617 attribués à J.B.

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux protocoles approuvés par le Comité des ressources animales de l’Université de Rochester. Les souris ont été élevées et maintenues dans les installations de soins aux animaux de l’Université de Rochester. Pour modéliser les SMD à haut risque, on utilise le modèle19 de souris murines NHD13 disponible dans le commerce. Dans ce modèle, les cellules stromales de la moelle osseuse sont analysées chez les souris femelles NHD13 à l’âge de 8 semaines, avant l’apparition de la maladie. De novo La LAM est générée comme décrit précédemment 6,11,20. Les oncogènes utilisés pour induire la LMA, tels que MLL-AF9 et NRas, sont marqués avec GFP ou YFP, ce qui permet d’analyser les populations de moelle osseuse non leucémiques GFP à l’aide de la cytométrie en flux. En bref, des souris femelles C57BL/6J âgées de 10 semaines sont transplantées avec des cellules murines GFP/YFP+ AML, et la moelle osseuse est prélevée 2 semaines après la greffe. Bien que les souris femelles soient utilisées dans cette étude à des fins de démonstration, ce protocole peut être effectué avec des souris mâles ou femelles. Elle peut également être réalisée à l’aide d’un fémur ou de tous les os longs.
1. Prélèvement de moelle osseuse
REMARQUE : Pour plus de détails sur le protocole de dissection animale, veuillez vous référer à Amend et al.26.
<ol><li>Nettoyez le mortier et le pilon avec de l’éthanol à 70 %, rincez-les avec un tampon FACS réfrigéré (tableau 1) et placez-les sur de la glace pour qu’ils refroidissent avant de commencer la récolte. Placez également le tampon MAC (tableau 1) sur le banc pour lui permettre d’atteindre la température ambiante.</li>
	<li>Euthanasier l’animal en suivant les lignes directrices et les protocoles de l’établissement en matière de soins et d’utilisation des animaux.</li>
	<li>Sur la paillasse, vaporisez abondamment la souris avec de l’éthanol à 70 % jusqu’à ce que sa fourrure soit mouillée. À l’aide d’une pince et de ciseaux courbés, soulevez la peau de l’abdomen et faites deux incisions d’environ 0,5 mm de longueur des deux côtés de la souris, latéralement à partir de l’abdomen. Ensuite, faites une incision de 0,5 mm distale à partir de l’abdomen. Tirez vers le bas pour enlever la peau et la fourrure des pattes de la souris.</li>
	<li>Placez les ciseaux perpendiculairement au bassin, appuyez tout en tirant sur le fémur avec une pince. La tête fémorale doit se détacher du bassin. Séparez le fémur et le tibia au niveau de l’articulation fémoro-patellaire. Placez les os dans le tampon FACS dans une plaque à 6 puits sur de la glace.</li>
	<li>Retirez les tissus des os à l’aide d’un tissu de qualité laboratoire et placez les os nettoyés dans une nouvelle plaque à 6 puits avec un tampon FACS frais sur de la glace.</li>
	<li>Placez tous les os dans le mortier avec 2 à 5 mL de tampon FACS afin que tous les os soient immergés dans le tampon (ajustez le volume du tampon en fonction du nombre d’os que vous traitez). Écrasez et broyez les os à l’aide du pilon dans un mouvement circulaire jusqu’à ce que le tissu de la moelle osseuse soit libéré.</li>
	<li>À l’aide d’une seringue de 3 ml, homogénéiser la moelle osseuse en tirant vers le haut et en évacuant le liquide du mortier.</li>
	<li>À l’aide d’une seringue de 3 ml, extraire le liquide du mortier et le filtrer à travers une crépine de 70 μm dans un tube de 50 ml sur de la glace. Rincez les morceaux d’os/tissu du filtre dans le mortier avec le tampon FACS et revenez à l’étape 1.7 pour homogénéiser et filtrer une deuxième fois. Celle-ci constitue la fraction de moelle osseuse.</li>
	<li>Rincez les morceaux d’os restants (spicules) dans le mortier avec le tampon FACS et rincez-les dans un tube de 15 ml à l’aide du tampon FACS pour assurer un rendement cellulaire maximal. Il s’agit de la fraction des spicules osseux.</li>
</ol>2. Digestion de la moelle osseuse
<ol><li>Centrifuger la moelle osseuse à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Décanter et jeter le surnageant.</li>
	<li>Remettre la moelle osseuse en suspension dans 2 mL du mélange de digestion de la moelle osseuse (tableau 1) et la transférer dans un tube de 15 mL. Incuber à 37 °C pendant 45 min sur un rotateur.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de tampon FACS pour arrêter la digestion enzymatique. Filtrez le mélange à travers une crépine de 70 μm dans un nouveau tube de 50 ml.</li>
	<li>Pelleter le mélange à 400 x g pendant 7 min à 4 °C.</li>
	<li>Remettre en suspension la pastille de moelle osseuse dans 1 mL de tampon de lyse des globules rouges (voir le tableau des matériaux). Incuber 4 min sur glace.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de tampon FACS pour arrêter la lyse. Filtrez le mélange à travers une crépine de 70 μm dans un nouveau tube de 50 ml.</li>
	<li>Pulvériser le mélange à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 100 μL de tampon FACS.</li>
</ol>3. Digestion des spicules osseux
<ol><li>Faites vortex les spicules osseux de l’étape 1.9 et laissez-les se déposer. Décanter le surnageant et conserver l’os en bas.</li>
	<li>Remettre les spicules osseux en suspension dans 1 mL du mélange de digestion des spicules osseux (tableau 1).</li>
	<li>Placez les tubes sur un rotateur de tubes pendant 60 min à 37 °C.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de tampon FACS pour arrêter la digestion enzymatique. Filtrer le mélange à travers une crépine cellulaire de 70 μm dans le tube de 50 mL contenant de la moelle osseuse lysée et digérée par les globules rouges.</li>
</ol>4. Coloration
<ol><li>Mélangez délicatement les spicules osseux et la suspension de cellules de moelle osseuse.</li>
	<li>Utiliser 10 μL de la suspension cellulaire pour compter le nombre de cellules vivantes sur un hémocytomètre en utilisant une coloration à base de bleu de trypan à 0,4 %, comme décrit dans les protocoles publiés27. Collectez 50 000 cellules pour un contrôle non coloré de la suspension cellulaire.</li>
	<li>Centrifuger les cellules restantes à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant et le remettre en suspension dans 100 μL de tampon FACS. REMARQUE : Les anticorps peuvent être titrés pour déterminer la dilution idéale. La sélection des anticorps (épitopes et fluorochromes) peut être personnalisée.</li>
	<li>Pour la coloration avec des anticorps pour la déplétion magnétique, ajouter le bloc FC (1 μL par 25 x 106 cellules), le CD45-APC (10 μL par 25 x 106 cellules) et le Ter119-APC (4 μL par 25 x 106 cellules) (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Incuber sur glace pendant 20 min. Laver avec un tampon FACS, retirer 50 000 cellules (~50 μL) pour le contrôle coloré par APC, centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C et remettre en suspension dans 100 μL de tampon FACS.</li>
	<li>Pour la coloration de la suspension cellulaire avec des microbilles pour l’appauvrissement magnétique, ajouter des mIgG (8 μL par 25 x 106 cellules) et des microbilles anti-APC (20 μL par 25 x 106 cellules) (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Incuber sur glace pendant 20 min. Laver avec un tampon FACS de 10 mL, centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
</ol>5. Épuisement de l’échantillon par tri magnétique
REMARQUE : Cette étape est effectuée à l’aide d’un séparateur magnétique manuel disponible dans le commerce conformément aux instructions du fabricant. Cette étape peut également être effectuée à l’aide d’un séparateur automatisé (voir Tableau des matériaux).
<ol><li>Préparez la colonne LD en la lavant avec 2 mL de tampon MACs (tableau 1). Jetez l’effluent et changez le tube de collecte.</li>
	<li>Remettre en suspension jusqu’à 1 x 108 cellules dans un tampon MAC et les filtrer à travers un tube à essai de 5 ml avec un capuchon de crépine de cellules de 35 μm.</li>
	<li>Placez la colonne LD sur le support du séparateur magnétique. Placez un tube à essai de 5 mL sous la colonne pour recueillir l’éluat.</li>
	<li>Ajoutez la suspension de cellule à la colonne LD préparée. Laissez la fraction négative s’écouler dans le tube de collecte. Lavez la colonne deux fois avec 1 mL de tampon MACs, en recueillant l’éluat dans le même tube. Il s’agit de la fraction négative utilisée à l’étape 5.6 ci-dessous.</li>
	<li>Retirez la colonne LD du support du séparateur magnétique et placez-la sur un nouveau tube à essai de 5 ml. À l’aide d’une pipette, verser 3 mL de tampon dans la colonne afin d’éliminer les cellules qui ont été marquées positivement, à l’aide du piston de colonne.</li>
	<li>Centrifuger les fractions négative et positive à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Mettez-les en suspension dans 100 μL de tampon FACS.</li>
	<li>Compter 10 μL des fractions négatives et positives avec 0,4 % de bleu de trypan. Les volumes pour l’ostéo-analyse/coloration du panel endothélial ci-dessous seront basés sur ce nombre de cellules.</li>
	<li>Utilisez 50 000 cellules vivantes de la fraction positive pour les contrôles de contrôle par cytométrie en flux.</li>
</ol>6. Ostéo-analyse/coloration du panneau endothélial
REMARQUE : La compensation doit être effectuée conformément aux protocoles standard de cytométrie en flux, y compris tous les contrôles de coloration et de déclenchement appropriés.
<ol><li>Pour la coloration de la fraction négative CD45/Ter119 (1 μL de chaque anticorps pour 1 x 106 cellules), ajouter CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE et CD140a-PE-Cy5 (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Incuber sur glace pendant 20 min. Laver avec 2 mL de tampon FACS, puis centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon FACS et une dilution de 1 :1000 de PI pour la coloration vivante/morte, puis filtrer l’échantillon à travers un tube à essai de 5 mL avec un capuchon de crépine de 35 μm.</li>
	<li>Analysez les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux multicolore.</li>
</ol>

Isolement et caractérisation du microenvironnement de la moelle osseuse dans les néoplasmes myéloïdes

<ol>
	<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Boulais, P. E., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+of+hematopoietic+stem+cell+niches.">Making sense of hematopoietic stem cell niches.</a> Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).</li><li>Pinho, S., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cell+activity+and+interactions+with+the+niche.">Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).</li><li>Kfoury, Y., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cell+contributions+to+the+stem+cell+niche.">Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).</li><li>Itkin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+bone+marrow+blood+vessels+differentially+regulate+haematopoiesis.">Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis.</a> Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).</li><li>Bajaj, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cd98-mediated+adhesive+signaling+enables+the+establishment+and+propagation+of+acute+myelogenous+leukemia.">Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia.</a> Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).</li><li>Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia+stem+cells+and+microenvironment:+Biology+and+therapeutic+targeting.">Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting.</a> J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).</li><li>Kim, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+notch+activation+in+microenvironment+leads+to+myeloproliferative+disease.">Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease.</a> Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).</li><li>Walkley, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microenvironment-induced+myeloproliferative+syndrome+caused+by+retinoic+acid+receptor+gamma+deficiency.">A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency.</a> Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).</li><li>Kode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukaemogenesis+induced+by+an+activating+&#946;-catenin+mutation+in+osteoblasts.">Leukaemogenesis induced by an activating &#946;-catenin mutation in osteoblasts.</a> Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).</li><li>Hanoun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myelogenous+leukemia-induced+sympathetic+neuropathy+promotes+malignancy+in+an+altered+hematopoietic+stem+cell+niche.">Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche.</a> Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).</li><li>Raaijmakers, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+progenitor+dysfunction+induces+myelodysplasia+and+secondary+leukaemia.">Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia.</a> Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).</li><li>Frisch, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+inhibition+of+osteoblastic+cells+in+an+in+vivo+mouse+model+of+myeloid+leukemia.">Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia.</a> Blood. 119 (2), 540-550 (2012).</li><li>Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+cancer+initiation+and+progression.">Stem cells in cancer initiation and progression.</a> J Cell Biol. 219 (1), e201911053 (2020).</li><li>Sekeres, M. A., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+treatment+of+myelodysplastic+syndromes:+A+review.">Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review.</a> Jama. 328 (9), 872-880 (2022).</li><li>Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snapshot:+Acute+myeloid+leukemia.">Snapshot: Acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 22 (5), 698-698.e1 (2012).</li><li>Krivtsov, A. V., Armstrong, S. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup98-hoxd13+transgenic+mice+develop+a+highly+penetrant,+severe+myelodysplastic+syndrome+that+progresses+to+acute+leukemia.">Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia.</a> Blood. 106 (1), 287-295 (2005).</li><li>Kwon, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraspanin+3+is+required+for+the+development+and+propagation+of+acute+myelogenous+leukemia.">Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).</li><li>Bajaj, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+genome-wide+crispr+screen+identifies+the+rna-binding+protein+staufen2+as+a+key+regulator+of+myeloid+leukemia.">An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia.</a> Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).</li><li>Krivtsov, A. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+microenvironment+at+single-cell+resolution.">The bone marrow microenvironment at single-cell resolution.</a> Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).</li><li>Balderman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+the+bone+marrow+microenvironment+improves+outcome+in+a+murine+model+of+myelodysplastic+syndrome.">Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 127 (5), 616-625 (2016).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> JoVE. 110, e53936 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> , (2023).</li><li>Passaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+vascular+permeability+in+the+bone+marrow+microenvironment+contributes+to+acute+myeloid+leukemia+progression+and+drug+response.">Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response.</a> Blood. 128 (22), 2662 (2016).</li><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+factor+is+selectively+secreted+by+arterial+endothelial+cells+in+bone+marrow.">Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow.</a> Nat Commun. 9 (1), 2449 (2018).</li><li>Baccin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+single-cell+and+spatial+transcriptomics+reveal+the+molecular,+cellular+and+spatial+bone+marrow+niche+organization.">Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization.</a> Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).</li><li>Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+digestion+strategies+on+characteristics+and+differentiation+potential+of+human+dental+pulp+stem+cells.">Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells.</a> Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).</li><li>Abreu-Velez, A. M., Howard, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+IV+in+normal+skin+and+in+pathological+processes.">Collagen IV in normal skin and in pathological processes.</a> N Am J Med Sci. 4 (1), 1-8 (2012).</li></ol>

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Les modèles de leucémie murine ont été largement utilisés pour identifier les signaux intrinsèques et de niche cellulaires qui favorisent la progression agressive de la leucémie myéloïde 6,19,21. Ici, un protocole complet basé sur la cytométrie en flux pour définir la composition cellulaire du microenvironnement de la moelle osseuse dans des modèles murins de SMD et de LAM est présenté.
<p class="jove_content"...

Le microenvironnement de la moelle osseuse est constitué de cellules hématopoïétiques, de cellules stromales non hématopoïétiques et de la matrice extracellulaire 1,2. Ce microenvironnement peut favoriser l’auto-renouvellement des cellules souches hématopoïétiques, réguler la différenciation des lignées et fournir un soutien structurel et mécanique au tissu osseux 1,2,3,4,5. La niche stromale comprend les cellules ostéolinéaires, les fibroblastes, les cellules nerveuses et les cellules endothéliales6, tandis que la niche hématopoïétique comprend les populations lymphoïdes et myéloïdes 1,2,3. En plus de soutenir les CSH normales, le microenvironnement de la moelle osseuse peut également jouer un rôle dans le développement de troubles des cellules souches hématopoïétiques tels que le SMD et la LMA 7,8,9,10,11. Il a été démontré que les mutations dans les cellules ostéoliférantes favorisent le développement du SMD, de la LAM et d’autres néoplasmes myéloprolifératifs 10,12,13,14.
Les syndromes myélodysplasiques sont un groupe de troubles pré-leucémiques qui résultent de mutations dans les cellules souches hématopoïétiques. Le SMD est souvent associé à un blocage de la différenciation des CSH et à la production de cellules dysplasiques, ce qui peut souvent entraîner une insuffisance de la moelle osseuse. Le SMD est le néoplasme myéloïde le plus fréquemment diagnostiqué aux États-Unis et est associé à un taux de survie à 3 ans de 35 % à 45 %15. Le SMD est souvent associé à un risque élevé de transformation en leucémie myéloïde aiguë. Il peut s’agir d’une complication fatale, car la LMA dérivée du SMD est résistante à la plupart des thérapies et susceptible de rechuter. La LAM qui survient de novo en raison de translocations ou de mutations dans la tige hématopoïétique et les progéniteurs est également souvent résistante à la chimiothérapie standard16,17. Étant donné que le SMD et la LMA sont principalement des maladies de personnes âgées, la majorité d’entre eux étant diagnostiqués avant l’âge de 60 ans, la plupart des patients ne sont pas admissibles à une greffe de moelle osseuse curative. Il y a donc un besoin important d’identifier de nouveaux régulateurs de la progression de la maladie. Étant donné que le microenvironnement de la moelle osseuse peut fournir un soutien aux cellules malignes14, la définition des changements dans la niche de la moelle osseuse avec la progression de la maladie peut conduire à l’identification de nouvelles thérapies visant à inhiber le remodelage de la niche tumorale. Il est donc important d’identifier de nouveaux régulateurs de la progression de la maladie. À cette fin, il est essentiel d’identifier et de caractériser les changements dans les populations de cellules stromales de la moelle osseuse qui peuvent fournir un soutien aux cellules malignes.
Plusieurs modèles murins de LAM et de SMD ont été générés et peuvent être utilisés pour étudier les changements dans le microenvironnement de la moelle osseuse au cours de l’initiation et de la progression de la maladie 6,1,19,20,21,22. Ici, les protocoles permettant d’identifier les changements dans les populations de cellules stromales de la moelle osseuse à l’aide de modèles murins de LAM 6,20 induite rétroviralement, ainsi que le modèle Nup98-HoxD13 (NHD13) disponible dans le commerce de la transformation du SMD à haut risque en LAM19, sont décrits. Les souris transplantées avec des cellules de LAM de novo succombent à la maladie en 20 à 30 jours6. Les souris NHD13 développent des cytopénies et une dysplasie de la moelle osseuse vers 15 à 20 semaines, qui se transforme finalement en LAM, et près de 75 % des souris succombent à la maladie vers 32 semaines. Pour analyser les populations du microenvironnement de moelle osseuse modèle murin, les os sont prélevés, la moelle osseuse et les spicules osseux sont digérés par digestion enzymatique, puis les cellules sont enrichies pour les populations non hématopoïétiques CD45-/Ter119- par tri magnétique. Bien que des analyses similaires aient déjà été décrites 11,13,22,23,24,25, elles se concentrent souvent sur la moelle osseuse ou l’os et n’intègrent pas de cellules des deux sources dans leurs analyses. La caractérisation combinée de ces populations, en conjonction avec des analyses de l’expression génique, peut fournir une compréhension complète de la façon dont le microenvironnement hématopoïétique cellulaire fournit un soutien à l’initiation et à la progression de la maladie (Figure 1). Bien que le protocole décrit ci-dessous se concentre sur un modèle de LAM induite par rétroviralité et un modèle de SMD génétique, ces stratégies peuvent être facilement adaptées pour étudier les changements dans la niche de la moelle osseuse de n’importe quel modèle murin d’intérêt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL pipette Tips&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>AVANT</td>
			<td>L211511-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L pipette Tips</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-140RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>Globe scientific</td>
			<td>1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Vacuum Filtration Flask</td>
			<td>NEST</td>
			<td>344021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10026-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Aspirating Pipette</td>
			<td>NEST</td>
			<td>325011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette Tips</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-150-RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>Globe scientific</td>
			<td>1780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>Globe scientific</td>
			<td>1740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube&#160; 12 x 75 mm style</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi&#160;</td>
			<td>130-090-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>4425745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>0.5 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>66.000 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>404-5981</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide Gas Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25-0311-82</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17-0451-82</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 70 &#181;m Nylon&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-63100-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>7415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Mini Centrifuge</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>6770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Stripettor Ultra Pipet Controller</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>117105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10x</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience 1x RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors - sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foundation B Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>900-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson&#160;PIPETMAN L Pipette Starter Kits</td>
			<td>FisherScientific&#160;</td>
			<td>F167370G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) 10x</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>BINDER</td>
			<td>C150-UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td>K222101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-425-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSE Vortex Mixer</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>6775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRII/Fortessa/Symphony A1</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>647800L6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MULTI STAND&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACsmix Tube Rotator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIgG</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>18765-10mg</td>
			<td>2 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td>010505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>104106</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135920</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastipak 3 mL Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS&#160; Separator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>75009521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17-5921-82</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying bone marrow microenvironmental populations in myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia

Le microenvironnement de la moelle osseuse est constitué de populations cellulaires distinctes, telles que les cellules stromales mésenchymateuses, les cellules endothéliales, les cellules ostéolignées et les fibroblastes, qui soutiennent les cellules souches hématopoïétiques (CSH). En plus de soutenir les CSH normales, le microenvironnement de la moelle osseuse joue également un rôle dans le développement de troubles des cellules souches hématopoïétiques, tels que les syndromes myélodysplasiques (SMD) et la leucémie myéloïde aiguë (LAM). Les mutations associées aux SMD dans les CSH entraînent un blocage de la différenciation et une insuffisance progressive de la moelle osseuse, en particulier chez les personnes âgées. Le SMD peut souvent évoluer vers une LAM résistante au traitement, une maladie caractérisée par une accumulation rapide de blastes myéloïdes immatures. On sait que le microenvironnement de la moelle osseuse est altéré chez les patients atteints de ces néoplasmes myéloïdes. Ici, un protocole complet pour isoler et caractériser phénotypiquement les cellules microenvironnementales de la moelle osseuse à partir de modèles murins de syndrome myélodysplasique et de leucémie myéloïde aiguë est décrit. L’isolement et la caractérisation des changements dans les populations de niche de la moelle osseuse peuvent aider à déterminer leur rôle dans l’initiation et la progression de la maladie et peuvent conduire à la mise au point de nouvelles thérapies ciblant les altérations favorisant le cancer dans les populations stromales de la moelle osseuse.

The bone marrow microenvironment consists of hematopoietic cells, non-hematopoietic stromal cells, and the extracellular matrix1,2. This microenvironment can promote hematopoietic stem cell self-renewal, regulate lineage differentiation, and provide structural and mechanical support to the bone tissue1,2,3,4,5. The stromal niche includes osteolineage cells, fibroblasts, nerve cells, and endothelial cells6, while the hematopoietic niche consists of the lymphoid and myeloid populations1,2,3. In addition to supporting normal HSCs, the bone marrow microenvironment can also play a role in the development of hematopoietic stem cell disorders such as MDS and AML7,8,9,10,11. Mutations in osteolineage cells have been shown to promote the development of MDS, AML, and other myeloproliferative neoplasms10,12,13,14.
Myelodysplastic syndromes are a group of pre-leukemic disorders that arise from mutations in hematopoietic stem cells. MDS is frequently associated with a block in HSC differentiation and the production of dysplastic cells, which can often lead to bone marrow failure. MDS is the most commonly diagnosed myeloid neoplasm in the United States and is associated with a 3-year survival rate of 35%-45%15. MDS is often associated with a high risk of transformation to acute myeloid leukemia. This can be a fatal complication, as MDS-derived AML is resistant to most therapies and likely to relapse. AML that arises de novo due to translocations or mutations in hematopoietic stem and progenitors is also often resistant to standard chemotherapy16,17. Since MDS and AML are primarily diseases of the elderly, with the majority diagnosed over the age of 60 years, most patients are ineligible for curative bone marrow transplants. There is, thus, a significant need to identify novel regulators of disease progression. Since the bone marrow microenvironment can provide support for malignant cells14, defining changes in the bone marrow niche with disease progression may lead to the identification of novel therapeutics aimed at inhibiting tumor niche remodeling. There is, therefore, a significant need to identify novel regulators of disease progression. To this end, it is critical to identify and characterize changes in the bone marrow stromal cell populations that may provide support for the malignant cells.
Several murine models of AML and MDS have been generated and can be used to study changes in the bone marrow microenvironment during disease initiation and progression6,1,19,20,21,22. Here, protocols to identify changes in the bone marrow stromal cell populations using murine models of retrovirally induced AML6,20, as well as the commercially available Nup98-HoxD13 (NHD13) model of high-risk MDS to AML transformation19, are described. Mice transplanted with de novo AML cells succumb to the disease in 20-30 days6. The NHD13 mice develop cytopenias and bone marrow dysplasia around 15-20 weeks, which eventually transforms into AML, and nearly 75% of the mice succumb to the disease around 32 weeks. To analyze the murine model bone marrow microenvironment populations, bones are harvested, bone marrow and bone spicules are digested using enzymatic digestion, and the cells are then enriched for CD45-/Ter119- non-hematopoietic populations by magnetic sorting. While similar analyses have been previously described11,13,22,23,24,25, they often focus on either the bone marrow or the bone and do not incorporate cells from both sources in their analyses. The combined characterization of these populations, in conjunction with gene expression analyses, can provide a comprehensive understanding of how the cellular hematopoietic microenvironment provides support for disease initiation and progression (Figure 1). While the protocol described below focuses on retrovirally induced AML model and a genetic MDS model, these strategies can be easily adapted to study changes in the bone marrow niche of any murine model of interest.

Pleins feux sur l’auteur : Analyse du microenvironnement de la moelle osseuse dans les hémopathies malignes murines 

Identification des populations microenvironnementales de moelle osseuse dans le syndrome myélodysplasique et la leucémie myéloïde aiguë

Our research aims to explore how the bone marrow's changing environment influences tumor growth. We developed a flow cytometry protocol to analyze the non-immune cells in bone marrow and bone tissues, focusing on murine hematological malignancies. This method is adaptable for studying bone marrow in various murine models.Our study focuses on isolating and identifying alterations in bone marrow stromal populations during cancer progression. Understanding their impact on disease onset and advancement could pave the way for new treatments that target these cancer-facilitating changes in the bone marrow stromal cells. Our protocol uniquely combines mechanical and enzymatic digestions, magnetic depletions, and flow cytometry to delineate the bone marrow microenvironment cellular makeup.It stands out by employing magnetic separation and incorporating cells from both bone and marrow, offering a more comprehensive representation of this microenvironment.

Cet article décrit une méthode basée sur la cytométrie en flux pour analyser les populations microenvironnementales de moelle osseuse, telles que les cellules stromales endothéliales et mésenchymateuses, à partir de modèles murins de SMD et de leucémie (Figure 1). La figure 2 illustre la stratégie de déclenchement pour la détection des populations d’intérêt, en commençant par la sélection des cellules (P1) dans la fraction digérée et appauvri...

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Un protocole détaillé pour isoler et caractériser les populations microenvironnementales de moelle osseuse à partir de modèles murins de syndromes myélodysplasiques et de leucémie myéloïde aiguë est présenté. Cette technique permet d’identifier les changements dans la niche de la moelle osseuse non hématopoïétique, y compris les cellules stromales endothéliales et mésenchymateuses, avec la progression de la maladie.

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and ...

Notre recherche vise à explorer comment l’environnement changeant de la moelle osseuse influence la croissance tumorale. Nous avons développé un protocole de cytométrie en flux pour analyser les cellules non immunitaires dans la moelle osseuse et les tissus osseux, en nous concentrant sur les hémopathies malignes murines. Cette méthode est adaptable à l’étude de la moelle osseuse dans divers modèles murins.Notre étude se concentre sur l’isolement et l’identification des altérations dans les populations stromales de moelle osseuse au cours de la progression du cancer. Comprendre leur impact sur l’apparition et la progression de la maladie pourrait ouvrir la voie à de nouveaux traitements qui ciblent ces changements facilitant le cancer dans les cellules stromales de la moelle osseuse. Notre protocole combine de manière unique des digestions mécaniques et enzymatiques, des déplétions magnétiques et une cytométrie en flux pour délimiter la composition cellulaire du microenvironnement de la moelle osseuse.Il se distingue par l’utilisation de la séparation magnétique et l’incorporation de cellules provenant à la fois de l’os et de la moelle, offrant une représentation plus complète de ce microenvironnement.

identifying-bone-marrow-microenvironmental-populations

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Identifying Bone Marrow Microenvironmental Populations in Myelodysplastic Syndrome and Acute Myeloid Leukemia

801 vues.  University of Rochester Medical Center. Notre recherche vise à explorer comment l’environnement changeant de la moelle osseuse influence la croissance tumorale. Nous avons développé un protocole de cytométrie en flux pour analyser les cellules non immunitaires dans la moelle osseuse et les tissus osseux, en nous concentrant sur les hémopathies malignes murines. Cette méthode est adaptable à l’étude de la moelle osseuse dans divers modèles murins.Notre étude se concentre sur l’isolement et l’identification d...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Analyse du microenvironnement de la moelle osseuse dans les hémopathies malignes murines 

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and fibroblasts, which provide support for hematopoietic stem cells (HSCs). In addition to supporting normal HSCs, the bone marrow microenvironment also plays a role in the development of hematopoietic stem cell disorders, such as myelodysplastic syndromes (MDS) and acute myeloid leukemia (AML). MDS-associated mutations in HSCs lead to a block in differentiation and progressive bone marrow failure, especially in the elderly. MDS can often progress to therapy-resistant AML, a disease characterized by a rapid accumulation of immature myeloid blasts. The bone marrow microenvironment is known to be altered in patients with these myeloid neoplasms. Here, a comprehensive protocol to isolate and phenotypically characterize bone marrow microenvironmental cells from murine models of myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia is described. Isolating and characterizing changes in the bone marrow niche populations can help determine their role in disease initiation and progression and may lead to the development of novel therapeutics targeting cancer-promoting alterations in the bone marrow stromal populations.

Here a detailed protocol to isolate and characterize bone marrow microenvironmental populations from murine models of myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia is presented. This technique identifies changes in the non-hematopoietic bone marrow niche, including the endothelial and mesenchymal stromal cells, with disease progression.

Recherche

Recherche en cancérologie

Murine Bone Marrow Harvest and Isolation for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment 

To begin, remove the tissue from the bones of the euthanized dissected mouse. Place the cleaned bones into a new six-well plate containing FACS buffer placed on ice. Transfer the bones into a mortar with two to five milliliters of FACS buffer.Grind the bones in a circular motion until the bone marrow is released. With a three milliliter syringe, pull up and flush down the bone marrow to homogenize it. Pull the homogenate into another syringe, then filter it through a 70 micrometer cell strainer into a 50 milliliter tube.Rinse the tissue chunks from their filter back into the mortar with FACS buffer before homogenizing a second time. Filter the rinsed tissue as before. Next, rinse the remaining bone spicules back into the mortar with FACS buffer.Then flush the pieces into a 15 milliliter tube to ensure maximum yield. To digest the bone marrow, first centrifuge it at 300 G for five minutes at four degrees Celsius. Resuspend the bone marrow pellet in two milliliters of digestion mixture.Transfer the mixture to a 15 milliliter tube. Then incubate it at 37 degrees Celsius for 45 minutes on a rotator. Now, add 10 milliliters of FACS buffer to stop the enzymatic digestion.Filter the mixture through a 70 micrometer cell strainer into a 50 milliliter tube. Centrifuge the suspension at 400 G for seven minutes at four degrees Celsius. Resuspend the pellet in one milliliter of RBC lysis buffer.Next, add 10 milliliters of FACS buffer to halt the lysis. Then filter the mixture as before into a 50 milliliter tube. Lastly, centrifuge the mixture at 300 G for five minutes at four degrees celsius.After discarding the supernatant, resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. For the digestion of bone spicules, first, vortex the bone spicules. Decant the supernatant and retain the bones at the bottom.Next, resuspend the spicules in one milliliter of the bone spicule digestion mixture. Incubate the tube on a rotator for 60 minutes at 37 degrees Celsius. Finally, stop the digestion with 10 milliliters of FACS buffer.Filter the mixture into the 50 milliliter tube containing RBC lysed and digested bone marrow.

Prélèvement et isolement de moelle osseuse murine pour la caractérisation du microenvironnement de la leucémie myéloïde 

Murine Bone Marrow Staining for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment

To begin, mix the isolated murine bone marrow suspension with the bone spicule suspension. Pipette 10 microliters of the cell suspension onto a hemocytometer for counting. Centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees Celsius.Then resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. To stain the cells with antibodies for magnetic depletion, add FC block, CD45 APC, and TER-119 APC. Then wash the cell suspension with FACS buffer.After centrifuging the remaining mixture, resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. To stain the cell suspension with microbeads for magnetic depletion, add mouse IgG and anti-APC microbeads. Incubate the mixture on ice for 20 minutes.Wash the LD column with two milliliters of MACS buffer. Resuspend the cells in the buffer, then filter it through a five milliliter test tube with a 35 micrometer cell strainer cap. Next, set the LD column on the magnetic separator stand and place a five milliliter test tube under the column to collect the eluted material.Pipette the cell suspension into the LD column and collect the negative fraction flow through in the test tube. Wash the column two times with one milliliter of MACS buffer and collect the eluent material in the same tube. Place the LD column over a new five milliliter test tube.With a pipette, dispense three milliliters of buffer into the column, then flush out the positively labeled cells into a five milliliter test tube. Centrifuge both the positive and negative fractions, then resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. To stain the CD45 TER-119 negative fraction add one microliter of each antibody for every 10 to the sixth cells.Place the suspension on ice for 20 minutes. Then wash the suspension with two milliliters of FACS buffer before centrifuging. Add one milliliter of the buffer to the pellet and pipette propidium iodide for live cell staining.Finally, filter the sample through a 35 micrometer cell strainer into a five milliliter test tube before analyzing the cells on a multicolor flow cytometer. Arteriolar endothelial cells significantly expanded in the acute myeloid leukemia microenvironment with a concomitant loss in the sinusoidal endothelial populations. A small expansion in the mesenchymal stromal cells were seen at eight weeks of age.