Para comenzar, mezcle la suspensión de médula ósea murina aislada con la suspensión de la espícula ósea. Pipetear 10 microlitros de la suspensión celular en un hemocitómetro para contar. Centrifugar la suspensión celular a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
A continuación, vuelva a suspender el gránulo en 100 microlitros de tampón FACS. Para teñir las células con anticuerpos para la depleción magnética, agregue el bloque FC, CD45 APC y TER-119 APC. A continuación, lave la suspensión celular con tampón FACS.
Después de centrifugar la mezcla restante, vuelva a suspender el gránulo en 100 microlitros de tampón FACS. Para teñir la suspensión celular con microperlas para el agotamiento magnético, agregue IgG de ratón y microperlas anti-APC. Incuba la mezcla en hielo durante 20 minutos.
Lavar la columna LD con dos mililitros de tampón MACS. Vuelva a suspender las células en el tampón, luego fíltrelo a través de un tubo de ensayo de cinco mililitros con una tapa de filtro celular de 35 micrómetros. A continuación, coloque la columna LD en el soporte del separador magnético y coloque un tubo de ensayo de cinco mililitros debajo de la columna para recoger el material eluido.
Pipetear la suspensión celular en la columna LD y recoger el flujo de fracción negativa en el tubo de ensayo. Lave la columna dos veces con un mililitro de tampón MACS y recoja el material eluyente en el mismo tubo. Coloque la columna LD sobre un nuevo tubo de ensayo de cinco mililitros.
Con una pipeta, dispense tres mililitros de tampón en la columna, luego enjuague las células marcadas positivamente en un tubo de ensayo de cinco mililitros. Centrifugar las fracciones positiva y negativa, luego resuspender el gránulo en 100 microlitros de tampón FACS. Para teñir la fracción negativa CD45 TER-119 añadir un microlitro de cada anticuerpo por cada 10 a la sexta células.
Coloque la suspensión sobre hielo durante 20 minutos. A continuación, lave la suspensión con dos mililitros de tampón FACS antes de centrifugarla. Agregue un mililitro del tampón al gránulo y pipetee yoduro de propidio para la tinción de células vivas.
Finalmente, filtre la muestra a través de un colador celular de 35 micrómetros en un tubo de ensayo de cinco mililitros antes de analizar las células en un citómetro de flujo multicolor. Las células endoteliales arteriolares se expandieron significativamente en el microambiente de la leucemia mieloide aguda con una pérdida concomitante en las poblaciones endoteliales sinusoidales. Se observó una pequeña expansión en las células estromales mesenquimales a las ocho semanas de edad.
