Transducción de preparación y reprogramación de lentivirus para células de adenocarcinoma ductal pancreático

1 2 Para comenzar, vea las células HEK 293T3 24 horas antes de la transfección 4 en un plato de 15 centímetros que contenga GMEN. 5 Incubar las células a 37 grados centígrados 6 y 5% de dióxido de carbono 7 hasta que alcancen un 40 a 50% de confluencia. 8 Etiquete tres tubos de plástico de 15 mililitros 9 con el nombre de lentivirus apropiado.

10 Añadir 1.710 mililitros de medio sérico reducido 11 y 90 microlitros de reactivo de transfección a cada tubo. 12 Mezcle el contenido mediante vórtice 13 antes de incubar los tubos a temperatura ambiente. 14 Después de cinco minutos, agregue la mezcla de vectores de empaque 15 al medio de transfección y al vórtice.

16 A continuación, añada 7,5 microgramos del vector de reprogramación 17 y el control pWPT-GFP 18 a la mezcla de transfección respectiva. 19 Agite los tubos durante dos segundos 20 antes de incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. 21 Para transfectar las células 293T con cada lentivirus, 22 gota a gota, agregue una mezcla de ADN de transfección en el plato.

23 Incubar las células transfectadas a 37 grados centígrados 24 y 5% de dióxido de carbono. 25 Después de 14 a 16 horas, 26 reemplace el medio con 30 mililitros 27 de medio 293T fresco 28 y continúe la incubación durante 60 a 72 horas. 29 Observar las células diariamente 30 y comprobar la eficiencia de la transfección.

31 A continuación, transfiera el cultivo de transfección del virus 32 a tubos de 15 mililitros 33 y centrifugue a 1.932 G durante 10 minutos 34 a cuatro grados centígrados. 35 Filtre el sobrenadante lentiviral 36 utilizando un filtro de jeringa de 0,45 micras 37 en un tubo nuevo de 50 mililitros. 38 Un día antes de la transducción del lentivirus, 39 se preparan dos pocillos de una placa de 6 pocillos 40 que contiene 100.000 células PDAC por pocillo.

41 Prepare dos tubos de 15 mililitros 42 con dos mililitros de medio PDAC precalentado. 43 En el primer tubo, 44 agregue 12 mililitros de lentivirus de reprogramación. 45 A continuación, añadir 12 microlitros de polibreno 46 y mezclar mediante pipeteo.

47 Al segundo tubo, 48 agregue dos microlitros de polibreno. 49 Ahora retire con cuidado el medio de cada pocillo 50 de una placa de 6 pocillos 51 y lave una vez con PBS a temperatura ambiente. 52 Agregue el medio de infección de reprogramación 53 desde el tubo uno hasta el primer pocillo.

54 Agrega la mezcla del tubo dos al segundo pocillo. 55 Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados 56 con 5% de dióxido de carbono y 5% de oxígeno. 57 Al día siguiente, reemplace el medio 58 de ambos pocillos por el medio PDAC 59 fresco y continúe la incubación 60 durante un máximo de 48 horas como se ha demostrado.