Preparación de células alimentadoras iMEF y transducción de reprogramación para células madre pluripotentes inducidas

1 Para comenzar, cubra la placa de 6 pocillos2 con dos mililitros de solución de gelatina al 0,2% por pocillo. 3 Incube la placa a 37 grados centígrados 4 y 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos. 5 A continuación, agregue gota a gota iMEFs en un tubo de 15 mililitros 6 que contiene 10 mililitros 7 de medio de fibroblastos humanos precalentado, 8 y mezcle invirtiendo suavemente el tubo.

9 Centrifugar la suspensión celular a 309 G durante tres minutos. 10 Y retire el sobrenadante antes de volver a suspender el pellet 11 en 12 mililitros de medio de fibroblastos humanos. 12 Coloque dos mililitros de la suspensión celular 13 en cada pocillo de la placa de seis pocillos recubierta de gelatina.

14 E incubar durante la noche a 37 grados centígrados 15 y 5% de dióxido de carbono. 16 Deseche el medio de la PDAC 17 infectada con lentivirus y no infectada, y lave las células dos veces con PBS. 18 Luego agrega 500 microlitros de tripsina para disociar las células.

19 E incubar a 37 grados centígrados 20 con 5% de dióxido de carbono y 5% de oxígeno 21 durante 15 minutos. 22 Centrifugar la suspensión celular a 300 G durante cinco minutos. 23 Y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio PDAC.

24 Lave la placa iMEF con medio PDAC. 25 A continuación, añada 50.000 células PDAC infectadas con lentivirus 26 por pocillo en cinco pocillos de placa iMEF, e incube durante la noche 27 como se demostró anteriormente. 28 Después de preparar el medio de reprogramación, 29 agregue 100 microlitros de factor de crecimiento de fibroblastos básicos de 30 a 100 mililitros de medio de reprogramación.

31 Al día siguiente, lave las células que crecen en los alimentadores iMEF dos veces 32 con medios de reprogramación precalentados. 33 Luego agregue dos mililitros de medio a cada pocillo, 34 e incube durante la noche a 37 grados centígrados 35 con 5% de dióxido de carbono y 3% de oxígeno. 36 Después de pasar cinco veces por el grupo de IPSC, 37 observan las colonias robustas 38 que mantienen una morfología similar a la de ESC.

39 El PDAC, BxPc3, 40 H6c7 y el fibroblasto humano 41 mostraron diferentes días de reprogramación 42 para formar una morfología madura similar a la ESC. Se establecieron 43 líneas clonales de IPSC, 44 de cada reprogramación de PDAC, 45 BxPc3, H6c7, 46 y células de fibroblastos humanos. 47 Todas las líneas IPSC establecidas dieron positivo 48 para TRA-160, lo que confirma su reprogramación a pluripotencia.