A.S y J.K desean agradecer a Cancer Research UK y OHSU por su financiación (Premio al proyecto CRUK-OHSU C65925/A26986). A.S cuenta con el apoyo de un premio de desarrollo profesional del MRC (MR/N024028/1). A.A está financiado por una beca de doctorado (Beca ref. 1078107040) de la Ciudad Rey Abdulaziz para la Ciencia y la Tecnología. J.K está financiado por la Subvención para Nuevos Investigadores de MRF (GCNCR1042A) y la Subvención Knight CEDAR (68182-933-000, 68182-939-000). Agradecemos al Prof. Keisuke Kaji por proporcionar amablemente el vector de reprogramación pSIN4-EF1a-O2S y pSIN4-CMV-K2M. A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia Creative Commons Attribution (CC BY) a cualquier versión del Manuscrito Aceptado por el Autor que surja de esta presentación.

Reprogramación de PDAC y células pancreáticas en células madre pluripotentes inducidas

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Con el fin de facilitar el uso de la reprogramación de iPSC para estudiar la progresión del cáncer, se ha establecido un protocolo sólido para la reprogramación de células de cáncer de páncreas. La reprogramación de las células cancerosas en pluripotencia ha demostrado ser muy difícil hasta ahora, ya que solo unos pocos estudios han generado con éxito iPSC a partir de células cancerosas 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46 <sup...

El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC, por sus siglas en inglés) es una de las neoplasias malignas más mortales, y el diagnóstico precoz sigue siendo un reto debido a la naturaleza asintomática de la enfermedad. La mayoría de los pacientes con PDAC son diagnosticados en el estadio metastásico avanzado, cuando se dispone de opciones de tratamiento muy limitadas 1,2. Esto se debe principalmente a la falta de biomarcadores fiables para las primeras etapas, como los que podrían detectarse convenientemente como proteínas liberadas en el torrente sanguíneo.
El PDAC puede diseminarse muy temprano durante su progresión, y un mejor pronóstico se ha relacionado con la detección temprana del cáncer cuando el PDAC se localiza en el páncreas3. Sin embargo, menos de una décima parte de los pacientes con PDAC son diagnosticados con un pronóstico favorable, lo que permite la resección quirúrgica. No obstante, los pocos con tumores resecables también son propensos a la recurrencia tumoral dentro de los 12 meses4.
En las últimas cinco décadas, se han logrado mejoras notables en las técnicas quirúrgicas, la atención al paciente y las modalidades de tratamiento 5,6. Sin embargo, la tasa de supervivencia a 5 años en pacientes con PDAC resecados quirúrgicamente apenas ha aumentado al 17%. Sin embargo, sigue siendo mejor que la de los pacientes no resecados, que se ha mantenido casi sin cambios (0,9%)4,7. La quimioterapia es el único otro tratamiento alternativo para el PDAC. Sin embargo, esta opción es muy limitada, ya que la gran mayoría de los pacientes con PDAC presentan una fuerte resistencia a los medicamentos quimioterápicos como la gemcitabina 7,8. Otros fármacos, como el erlotinib, solo están disponibles para un pequeño grupo de pacientes con PDAC con mutaciones específicas, la mayoría de los cuales muestran resistencia al erlotinib9. Los efectos secundarios adversos asociados a la quimioterapia en la mayoría de los pacientes con PDAC son otra desventaja de este tratamiento10. Recientemente, estrategias prometedoras han demostrado que los inhibidores de puntos de control inmunitario (ICI) y los inhibidores de la quinasa de molécula pequeña (SMKI) pueden ser eficaces en el tratamiento de la PDAC, pero las respuestas duraderas a estas terapias dirigidas siguen estando limitadas a una minoría de pacientes11,12. En general, el descubrimiento de biomarcadores tempranos específicos de PDAC puede allanar nuevas vías para el diagnóstico y el tratamiento tempranos.
El PDAC se desarrolla a partir de lesiones precursoras de neoplasias intraepiteliales pancreáticas (PanIN) que resultan de proliferaciones epiteliales no invasivas del conducto pancreático13,14. Si bien la formación de PanIN se inicia por mutaciones oncogénicas como KRAS, se requieren alteraciones genéticas y epigenéticas adicionales para la progresión a PDAC. Se ha proyectado que la progresión de la PanIN a través de las diferentes etapas hasta el PDAC invasivo tarda unos 10 años 13,15,16,17. Este período de tiempo ofrece una gran oportunidad para beneficiarse del diagnóstico precoz de PDAC. Por lo tanto, se ha llevado a cabo una amplia investigación para establecer modelos animales de xenoinjertos tumorales y cultivos de organoides para estudiar la progresión de PDAC 18,19,20,21. Estos modelos han sido muy útiles para estudiar las etapas invasivas de PDAC, aunque no la transición de las fases tempranas de PanIN. Por lo tanto, es importante desarrollar modelos experimentales que puedan recapitular la progresión temprana de las etapas de PanIN para permitir el descubrimiento de biomarcadores de detección temprana.
La reprogramación de células somáticas en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) utilizando los cuatro factores de transcripción OCT4, SOX2, KLF4 y c-MYC (OSKM) ha ilustrado el alcance de la plasticidad celular22. La plasticidad de las células cancerosas ha sido bien documentada, y la reprogramación de células cancerosas humanas en iPSC se ha utilizado con éxito para restablecer las células a su estado celular original, eliminando muchas de las agresiones epigenéticas que se han acumulado durante la progresión del cáncer 23,24,25,26,27,28,29. Por lo tanto, la posibilidad de utilizar esta estrategia de reprogramación para manipular la identidad de las células cancerosas ha sido muy prometedora en el tratamiento del cáncer30,31. De hecho, hemos demostrado previamente que la diferenciación de las iPSCs derivadas de las PDACs puede recapitular la progresión de las PDAC a través de las primeras etapas de PanIN32. Mediante la identificación de genes y vías específicas de las etapas tempranas e intermedias del PDAC, se identificaron biomarcadores candidatos que pueden ser utilizados clínicamente para el diagnóstico precoz del PDAC32,33. Sin embargo, los biomarcadores descubiertos utilizando una sola línea de iPSC mostraron una cobertura limitada en la mayoría de los pacientes con PDAC32. Los desafíos de generar líneas de iPSC a partir de otros pacientes con PDAC han detenido la capacidad de descubrir biomarcadores más confiables. Esto se debe a muchos factores técnicos, incluida la heterogeneidad de la administración de OSKM, ya que solo una pequeña parte de las células PDAC primarias humanas contenían los cuatro factores y respondieron con éxito a la reprogramación. Aquí, se presenta un protocolo detallado para la reprogramación de células PDAC primarias utilizando una administración lentiviral dual más eficiente y consistente de OSKM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31350010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>330613</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Pituitary Extract (BPE)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13028014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BxPc3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1687</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>C8052-1MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, Type I solution from rat tail</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>C3867</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Completed Defined K-SFM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;10744-019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS3516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning syringe filters</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS431231</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS430599</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day Impex&#160;Virkon Disinfectant Virucidal Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12328667</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>D8537</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10270-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene HD Transfection Reagent&#160;</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>&#160;E2312</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, Type B, 2% in H2O</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>G1393-100ML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>G5154</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF Recombinant Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>100-18B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7)</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECA001-FP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMEF feeder cells&#160;</td>
			<td>iXcells Biotechnologies</td>
			<td>10MU-001-1V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte Serum Free Media (KSFM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17005-042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10829018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut serum Replacement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030-024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HP 0.45 &#956;M syringe Filter Unit (Sterile)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>SLHP033RS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDG&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>187440</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)&#160;</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>H9268-5G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-CMV-K2M&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>21164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF2-O2S&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>21162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>12260</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pWPT-GFP&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>12255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (ATCC modification)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1049101</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodym Pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11360-039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringes for Single Use (60 mL)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15899152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reprogramming pancreatic ductal adenocarcinoma to pluripotency

La generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) utilizando factores de transcripción se ha logrado a partir de casi cualquier tipo de célula diferenciada y ha demostrado ser muy valiosa para la investigación y las aplicaciones clínicas. Curiosamente, se ha demostrado que la reprogramación iPSC de las células cancerosas, como el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), revierte el fenotipo invasivo de PDAC y anula el epigenoma del cáncer. La diferenciación de las iPSC derivadas de PDAC puede recapitular la progresión de PDAC a partir de su precursor temprano de la neoplasia intraepitelial pancreática (PanIN), revelando los cambios moleculares y celulares que ocurren temprano durante la progresión de PDAC. Por lo tanto, las iPSC derivadas de PDAC se pueden utilizar para modelar las primeras etapas de PDAC para el descubrimiento de marcadores de diagnóstico de detección temprana. Esto es particularmente importante para los pacientes con PDAC, que generalmente se diagnostican en las etapas metastásicas tardías debido a la falta de biomarcadores confiables para las etapas anteriores de PanIN. Sin embargo, la reprogramación de líneas celulares cancerosas, incluida la PDAC, en pluripotencia sigue siendo un desafío, requiere mucha mano de obra y es muy variable entre las diferentes líneas. Aquí, describimos un protocolo más consistente para generar iPSCs a partir de varias líneas celulares PDAC humanas utilizando vectores lentivirales bicistrónicos. Las líneas de iPSC resultantes son estables, no mostrando dependencia de la expresión exógena de factores de reprogramación o fármacos inducibles. En general, este protocolo facilita la generación de una amplia gama de iPSCs derivadas de PDAC, lo cual es esencial para descubrir biomarcadores tempranos que sean más específicos y representativos de los casos de PDAC.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most fatal malignancies, and early diagnosis remains challenging due to the asymptomatic nature of the disease. The majority of PDAC patients are diagnosed at the advanced metastatic stage when very limited treatment options are available1,2. This is mainly due to the lack of reliable biomarkers for the earlier stages, such as those that could be conveniently detected as proteins released into the bloodstream.
PDAC can disseminate very early during its progression, and a better prognosis has been linked to early cancer detection when PDAC is localized in the pancreas3. However, less than a tenth of PDAC patients are diagnosed with a favorable prognosis, allowing for surgical resection. Nonetheless, those few with resectable tumors are also prone to tumor recurrence within 12 months4.
In the past five decades, remarkable improvements have been made in surgical techniques, patient care, and treatment modalities5,6. However, the 5-year survival rate in surgically resected PDAC patients has barely risen to 17%. Nonetheless, this is still better than that in non-resected patients, which has remained almost unchanged (0.9%)4,7. Chemotherapy is the only other alternative PDAC treatment. Yet, this option is very limited as the great majority of PDAC patients exhibit strong resistance to chemotherapy medications such as Gemcitabine7,8. Other drugs, such as Erlotinib, are only available to a small group of PDAC patients with specific mutations, most of whom show Erlotinib resistance9. The adverse side effects associated with chemotherapy in most PDAC patients are yet another disadvantage of this treatment10. Recently, promising strategies have shown that immune checkpoint inhibitors (ICIs) and small molecule kinase inhibitors (SMKIs) can be effective in treating PDAC, but durable responses to these targeted therapies remain limited to a minority of patients11,12. Overall, the discovery of PDAC-specific early biomarkers can pave new avenues for early diagnosis and treatment.
PDAC develops from pancreatic intraepithelial neoplasms (PanIN) precursor lesions that result from non-invasive pancreatic duct epithelial proliferations13,14. While the formation of PanIN is initiated by oncogene mutations such as KRAS, additional genetic and epigenetic alterations are required for the progression to PDAC. It has been projected that the progression of PanIN through the different stages into invasive PDAC takes about 10 years13,15,16,17. This timeframe provides a great opportunity to benefit from early PDAC diagnosis. Therefore, extensive research has been carried out to establish tumor xenograft animal models and organoid cultures to study PDAC progression18,19,20,21. These models have been very useful for studying the invasive stages of PDAC, although not the transition from the early PanIN phases. It is, therefore, important to develop experimental models that can recapitulate the early progression of PanIN stages to enable the discovery of early detection biomarkers.
Reprogramming somatic cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs) using the four transcription factors OCT4, SOX2, KLF4, and c-MYC (OSKM) has illustrated the extent of cellular plasticity22. Cancer cell plasticity has been well-documented, and reprogramming human cancer cells into iPSCs has been successfully used to reset cells to their original cellular state, removing many of the epigenetic insults that have accumulated during cancer progression23,24,25,26,27,28,29. The possibility of using this reprogramming strategy to manipulate cancer cell identity has, therefore, presented great promise in treating cancer30,31. Indeed, we have previously shown that the differentiation of iPSCs derived from PDACs can recapitulate PDAC progression through the early PanIN stages32. By identifying genes and pathways specific to the early-to-intermediate stages of PDAC, candidate biomarkers were identified that can be clinically used for early PDAC diagnosis32,33. However, the biomarkers discovered using a single iPSC line showed limited coverage in the majority of PDAC patients32. The challenges of generating iPSC lines from other PDAC patients have halted the ability to discover more reliable biomarkers. This is due to many technical factors, including the heterogeneity of OSKM delivery, as only a small portion of human primary PDAC cells contained all four factors and responded successfully to reprogramming. Here, a detailed protocol is presented for reprogramming primary PDAC cells using a more efficient and consistent dual lentiviral delivery of OSKM.

Autor destacado: Reprogramación de células cancerosas a iPSC para estudiar la progresión de la enfermedad y los objetivos del tratamiento

Reprogramación del adenocarcinoma ductal de páncreas a pluripotencia

1 One of the most challenging aspects of studying PDAC<v>2 or pancreatic cancer is the availability 3 of an experimental model 4 that can recapitulate the progression 5 of PDAC from the early proline stages 6 to the aggressive state. 7 The other challenge is to experimentally capture 8 the plasticity and heterogeneity of PDAC. 9 So using PDAC IPS cells will help us tackle 10 some of these challenges 11 and expand our experimental tools to study this disease.12 We have established a robust protocol 13 to reprogram PDACs to iPS cells. 14 By generating more iPS lines from many more PDAC patients, 15 we can study the transition of pancreatic cancer 16 from early to advanced stages and see the commonalities 17 and differences between these lines. 18 This will help us discover early diagnostic markers 19 that cover more patients, 20 and generate drugs that target 21 the different states of the disease.22 The interesting question that came out of reprogramming 23 PDAC to iPS cells is what makes this cancer 24 so resistant to sulfate conversion compared to normal cells? 25 Is this due to specific genes or genetic mutations 26 that tell us something about cancer cell identity?

En la Figura 1 se muestran imágenes representativas que muestran la morfología de las colonias de iPSC derivadas de las células PDAC, BXPc3, H6C7 y hFib. Las colonias PDAC-iPSC comenzaron a formarse el día 25 de la reprogramación. En el día 40 de la reprogramación se identificaron colonias robustas de iPSC con una morfología similar a la de ESC más establecida (Figura 1). Del mismo modo, la formación de BxPc3-iPSCs come...

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El presente protocolo describe la reprogramación del adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) y las células epiteliales ductales pancreáticas normales en células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Proporcionamos un procedimiento optimizado y detallado, paso a paso, desde la preparación de lentivirus hasta el establecimiento de líneas estables de iPSC.

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...

reprogramming-pancreatic-ductal-adenocarcinoma-to-pluripotency

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

513 vistas.  The University of Edinburgh. 1 Uno de los aspectos más desafiantes del estudio de PDAC2 o cáncer de páncreas es la disponibilidad 3 de un modelo experimental 4 que puede recapitular la progresión 5 de PDAC desde las etapas tempranas de prolina 6 hasta el estado agresivo. 7 El otro desafío es capturar experimentalmente 8 la plasticidad y heterogeneidad de PDAC. 9 Por lo tanto, el uso de celdas PDAC IPS nos ayudará a abordar 10 algunos de estos desafíos 11 y expandir nuestra Herr...

Video: Autor destacado: Reprogramación de células cancerosas a iPSC para estudiar la progresión de la enfermedad y los objetivos del tratamiento

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has proved highly valuable for research and clinical applications. Interestingly, iPSC reprogramming of cancer cells, such as pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), has been shown to revert the invasive PDAC phenotype and override the cancer epigenome. The differentiation of PDAC-derived iPSCs can recapitulate PDAC progression from its early pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN) precursor, revealing the molecular and cellular changes that occur early during PDAC progression. Therefore, PDAC-derived iPSCs can be used to model the earliest stages of PDAC for the discovery of early-detection diagnostic markers. This is particularly important for PDAC patients, who are typically diagnosed at the late metastatic stages due to a lack of reliable biomarkers for the earlier PanIN stages. However, reprogramming cancer cell lines, including PDAC, into pluripotency remains challenging, labor-intensive, and highly variable between different lines. Here, we describe a more consistent protocol for generating iPSCs from various human PDAC cell lines using bicistronic lentiviral vectors. The resulting iPSC lines are stable, showing no dependence on the exogenous expression of reprogramming factors or inducible drugs. Overall, this protocol facilitates the generation of a wide range of PDAC-derived iPSCs, which is essential for discovering early biomarkers that are more specific and representative of PDAC cases.

The present protocol describes the reprogramming of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (PDAC) and normal pancreatic ductal epithelial cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs). We provide an optimized and detailed, step-by-step procedure, from preparing lentivirus to establishing stable iPSC lines.

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Lentivirus Preparation and Reprogramming Transduction for Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Cells

1 2 To begin, see the HEK 293T cells<v>3 24 hours before transfection 4 in a 15 centimeter dish containing GMEN. 5 Incubate the cells at 37 degrees Celsius 6 and 5%carbon dioxide 7 until they reach 40 to 50%confluency. 8 Label three 15 milliliter plastic tubes 9 with the appropriate lentivirus name.10 Add 1.710 milliliters of reduced serum medium 11 and 90 microliters of transfection reagent to each tube. 12 Mix the contents by vortexing 13 before incubating the tubes at room temperature. 14 After five minutes, add the packaging vector mixture 15 to the transfection medium and vortex.16 Then add 7.5 micrograms of reprogramming vector 17 and the pWPT-GFP control 18 to the respective transfection mixture. 19 Vortex the tubes for two seconds 20 before incubating for 15 minutes at room temperature. 21 To transfect the 293T cells with each lentivirus, 22 dropwise, add a transfection DNA mixture into the dish.23 Incubate the transfected cells at 37 degrees Celsius 24 and 5%carbon dioxide. 25 After 14 to 16 hours, 26 replace the medium with 30 milliliters 27 of fresh 293T medium 28 and continue incubation for 60 to 72 hours. 29 Observe the cells daily 30 and check transfection efficiency.31 Next, transfer the virus transfection culture 32 into 15 milliliter tubes 33 and spin down at 1, 932 G for 10 minutes 34 at four degrees Celsius. 35 Filter the lentiviral supernatant 36 using a 0.45 micron syringe filter 37 into a new 50 milliliter tube. 38 One day before lentivirus transduction, 39 prepare two wells of a 6-well plate 40 containing 100, 000 PDAC cells per well.41 Prepare two 15 milliliter tubes 42 with two milliliters of pre-warmed PDAC medium. 43 In the first tube, 44 add 12 milliliters of reprogramming lentivirus. 45 Then add 12 microliters of polybrene 46 and mix by pipetting.47 To the second tube, 48 add two microliters of polybrene. 49 Now carefully remove the medium from each well 50 of a 6-well plate 51 and wash once with PBS at room temperature. 52 Add the reprogramming infection medium 53 from tube one to the first well.54 Add the mixture from tube two to the second well. 55 Incubate the cells overnight at 37 degrees Celsius 56 with 5%carbon dioxide and 5%oxygen. 57 The next day, replace the medium 58 from both wells with fresh PDAC medium 59 and continue incubation 60 for up to 48 hours as demonstrated.

Transducción de preparación y reprogramación de lentivirus para células de adenocarcinoma ductal pancreático

Preparation of iMEF Feeder Cells and Reprogramming Transduction for Induced Pluripotent Stem Cells

1 To begin, coat the 6-well plate<v>2 with two milliliters of 0.2%gelatin solution per well. 3 Incubate the plate at 37 degrees Celsius 4 and 5%carbon dioxide for 30 minutes. 5 Next, drop-wise add iMEFs into a 15 milliliter tube 6 containing 10 milliliters 7 of pre-warmed human fibroblast medium, 8 and mix by gently inverting the tube.9 Centrifuge the cell suspension at 309 G for three minutes. 10 And remove the supernatant before re-suspending the pellet 11 in 12 milliliters of human fibroblast medium. 12 Place two milliliters of the cell suspension 13 into each well of the gelatin-coated six well plate.14 And incubate overnight at 37 degrees Celsius 15 and 5%carbon dioxide. 16 Discard the medium from the lentivirus-infected 17 and non-infected PDAC, and wash the cells twice with PBS. 18 Then add 500 microliters of trypsin to dissociate the cells.19 And incubate at 37 degrees Celsius 20 with 5%carbon dioxide and 5%oxygen 21 for 15 minutes. 22 Centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes. 23 And re-suspend the pellet in one milliliter of PDAC medium.24 Wash the iMEF plate with PDAC medium. 25 Then add 50, 000 lentivirus-infected PDAC cells 26 per well in five wells of iMEF plate, and incubate overnight 27 as demonstrated previously. 28 After preparing the reprogramming medium, 29 add 100 microliters of basic fibroblasts growth factor 30 to 100 milliliters of reprogramming medium.31 The next day, wash the cells growing on iMEF feeders twice 32 with pre-warmed reprogramming media. 33 Then add two milliliters of media to each well, 34 and incubate overnight at 37 degrees Celsius 35 with 5%carbon dioxide and 3%oxygen. 36 After passing the IPSC pool five times, 37 observe the robust colonies 38 maintaining ESC-like morphology.39 The PDAC, BxPc3, 40 H6c7, and human fibroblast 41 showed different days of reprogramming 42 to form a mature ESC-like morphology. 43 Clonal IPSC lines were established 44 from each reprogramming of PDAC, 45 BxPc3, H6c7, 46 and human fibroblast cells. 47 All established IPSC lines stained positive 48 for TRA-160, confirming their reprogramming to pluripotency.