Comience por descargar los semimapas sin enfocar de la apo-enolasa de datos adicionales en EMDB. A continuación, abra ChimeraX y haga clic en Abrir en la barra de herramientas. Seleccione los semimapas de apo-enolasa.
Escriba esto en la línea de comandos para combinar los medios mapas y obtener el mapa sin enfocar de apo-enolasa. Ajuste el umbral del mapa a 0,0595 para reducir el ruido. A continuación, escriba este comando para cambiar el nombre del mapa combinado.
Haga clic en Abrir. Seleccione los semimapas sin enfocar de PEP enolase y escriba este comando en la línea de comandos. Ajuste el umbral del mapa a 0,0721 para reducir el ruido y cambiar el nombre del mapa.
A continuación, muestre los mapas sin enfocar de la apo-enolasa y la enolasa PEP y haga clic en Ajustar en el panel Mapa para calcular un mapa de diferencias. Escriba este comando en la línea de comandos para restar el mapa de enolasa PEP del mapa de apoenolasa y ajustar el umbral. Colorea el mapa sustraído en verde, denotando densidad positiva.
A continuación, abra PDB y descargue las coordenadas de la enolasa octamérica de mycobacterium tuberculosis. Luego, en ChimeraX, haga clic en Abrir en la barra de herramientas y seleccione el nombre del archivo. Haga clic en Visualización de moléculas, Ocultar átomos y Mostrar dibujos animados.
Escriba este comando para cambiar el nombre del modelo. Seleccione el modelo en el panel Modelo. Haga clic con el botón derecho del ratón en la barra de herramientas.
A continuación, haga clic en Mover modelo y coloque el modelo cerca del mapa de enolasa PEP. Alinee el modelo con respecto al mapa. Ajuste este modelo en el mapa sin enfocar de PEP enolasa escribiendo este comando en la línea de comandos.
Comprueba el ajuste. Ajuste el color y la representación de la estructura. Abra Coot desde la terminal escribiendo coot&Click en Archivo, luego Abrir Coordenadas y seleccione Apo-enolase.pdb.
A continuación, descargue el mapa de enolase agudizado ligado a PEP de EMDB. Muestre este mapa en Coot haciendo clic en Archivo y Abrir mapa. Desplácese por el botón central del ratón para establecer el umbral en 7,00 sigma.
Haga clic en Validar y, a continuación, en Blobs sin modelar. En la nueva ventana, escriba 7.00 como RMSD y haga clic en Buscar blobs. Ubique la densidad de ligando no modelada cerca de los residuos del sitio activo, serina 42, lisina 386 y arginina 364.
A continuación, haga clic en Archivo, Obtener monómero e ingrese PEP para obtener el archivo del modelo de monómero PEP de la biblioteca de monómeros de Focha. Mueva la molécula de PEP a la densidad usando la opción Rotar Trasladar Molécula de Cadena de Zona en el menú de la barra lateral. A continuación, haga clic en Zona refinada del espacio real en el menú de la barra lateral para ajustar la molécula de PEP en la densidad.
Evalúe el ajuste y haga clic en Aceptar cuando haya terminado. Utilice la opción Fusionar molécula de la pestaña Editar para fusionar el ligando ajustado con el modelo de apoenolasa y guardar el modelo como PEP enolase.pdb. A continuación, haga clic en Calcular, Herramientas NCS, seguido de Ligandos NCS para añadir ligandos al resto de monómeros en el archivo de coordenadas.
Para la opción de proteína con NCS, seleccione el archivo de coordenadas apo-enolasa. pdb y el ID de cadena A como cadena maestra NCS. A continuación, para la molécula que contiene ligando, seleccione la apo-enolasa.
pdb como archivo de coordenadas, ID de cadena J y número de residuo 121. Haga clic en Buscar puestos de candidatos. Haga clic en los ligandos candidatos individuales y analice visualmente el ajuste.
A continuación, modele dos iones de magnesio en la densidad del sitio activo haciendo clic en Colocar átomo en el puntero y seleccionando MG de la lista Tipo de átomo de puntero. Además, agregue los iones de magnesio en los monómeros relacionados con la simetría. Evaluar el ajuste de los átomos de magnesio relacionados con la simetría.
Guarde el modelo haciendo clic en Archivo, luego en Guardar coordenadas. Seleccione el nombre del archivo y escriba enolase más PEP más MG.pdb. A continuación, abra la GUI de Phoenix.
Ejecute un trabajo de refinamiento del espacio real utilizando los parámetros predeterminados con el modelo guardado y el mapa de nitidez enlazado con PEP. Para visualizar el ligando modelado, abra PyMOL, haga clic en Archivo y Abrir para cargar el modelo refinado del trabajo de refinamiento de Phoenix. Cargue también el mapa nítido vinculado a PEP.
Cambie el nombre del mapa a PEP afilado haciendo clic en Acciones y luego en Cambiar nombre. A continuación, seleccione los ligandos haciendo clic en Pantalla seguido de Secuencia. Escríbalo en la línea de comandos y pulse Intro.
Esto esculpe la densidad del mapa alrededor de la selección. Haga clic en la última casilla, C, junto al objeto mesh_ligand para cambiar el color de la malla del ligando a azul. Muestre los residuos del sitio activo que interactúan con el PEP y los iones de magnesio en la representación de barras y esferas y la enzima enolasa en la representación de dibujos animados.
Establezca el tamaño de la malla. Escríbalo en la línea de comandos para realizar el trazado de rayos y guardar la imagen como un archivo PNG. Durante la glucólisis, la enolasa convierte dos fosfogliceratos en fosfoenolpiruvato, un intermediario vital para varias vías metabólicas.
El mapa de diferencias de la enzima apo y la enzima unida a PEP mostró una densidad de ligando distinta. Además, se observó una densidad adicional en el sitio activo de la proteína modelada. Se modelaron fosfoenolpiruvato y dos iones de magnesio en la densidad observada en las proximidades del ligando.
El fosfoenolpiruvato formó enlaces de hidrógeno con varios residuos del sitio activo, como la lisina 386 y la arginina 364. Los iones de magnesio formaron enlaces de coordinación metálicos con el aspartato 241, el glutamato 283, el aspartato 310 y el fosfato de fosfoenolpiruvato.
