SJ는 DAE-TIFR로부터 박사 과정 학생을 받았으며 자금 지원이 인정됩니다. KRV는 DBT B-Life 보조금 DBT/PR12422/MED/31/287/2014 및 프로젝트 식별 번호에 따라 인도 정부 원자력부의 지원을 인정합니다. RTI4006.

저분자 리간드(Small Molecule Ligands)의 CryoEM 맵 모델링

저자는 밝힐 것이 없습니다.

현미경 하드웨어 및 소프트웨어의 개선으로 최근 몇 년 동안 CryoEM 구조의 수가 증가했습니다. 단일 입자 cryoEM에서 현재 달성된 최고 분해능은 1.2 Å 57,58,59이지만 대부분의 구조는 약 3-4 Å 분해능으로 결정되고 있습니다. 중해상도에서 저해상도 맵의 리간드를 모델링하는 것은 까다로울 수 있으며 종종 모호성이 발생할 수 있?...

세포는 무수한 화학 반응을 동시에 독립적으로 수행함으로써 기능을 수행하며, 각 화학 반응은 환경 신호에 대한 반응으로 생존과 적응성을 보장하기 위해 세심하게 조절됩니다. 이는 생체 분자, 특히 단백질이 다른 거대분자 및 소분자 또는 리간드와 함께 일시적이거나 안정적인 복합체를 형성할 수 있도록 하는 분자 인식에 의해 달성됩니다1. 따라서 단백질-리간드 상호 작용은 단백질 발현 및 활성의 조절, 효소에 의한 기질 및 보조 인자의 인식, 세포가 신호를 인식하고 전달하는 방법을 포함하는 생물학의 모든 과정에 기본이 됩니다 1,2. 단백질-리간드 복합체의 동역학적, 열역학적, 구조적 특성을 더 잘 이해하면 리간드 상호작용의 분자적 기초를 밝히고 약물 상호작용 및 특이성을 최적화하여 합리적인 약물 설계를 촉진할 수 있습니다. 단백질-리간드 상호 작용을 연구하는 경제적이고 빠른 접근 방식은 다양한 범위의 작은 분자를 가상으로 스크리닝하고 이러한 리간드의 결합 모드와 친화도를 예측하여 표적 단백질에 대한 친화도를 예측하는 계산 방법인 분자 도킹을 사용하는 것입니다3. 그러나 X선 회절(XRD), 핵 자기 공명(NMR) 또는 전자 초저온 현미경(cryoEM)으로 측정된 고해상도 구조의 실험적 증거는 이러한 예측에 대한 필수 증거를 제공하고 주어진 표적에 대한 새롭고 더 효과적인 활성제 또는 억제제의 개발을 지원합니다. 이 기사에서는 일반적으로 언급되는 기술인 'cryoEM'이라는 약어를 사용합니다. 그러나 올바른 명명법을 선택하는 것에 대한 논쟁이 진행 중이며, 최근에는 샘플이 극저온 온도에 있고 전자로 이미징되었음을 나타내기 위해 cryogenic-sample Electron Microscopy(cryoEM)라는 용어가 제안되었습니다4. 마찬가지로 CryoEM에서 파생된 맵은 전자 전위, 정전기 전위 또는 쿨롱 전위라고 하며 단순화를 위해 여기서는 CryoEM 맵 5,6,7,8,9,10을 사용합니다.
XRD는 단백질-리간드 복합체의 고분해능 구조 측정에서 황금 표준 기술이었지만, 지난 몇 년 동안 전자 현미경 데이터베이스(EMDB)12,13에 기탁된 쿨롱 전위 맵 또는 cryoEM 맵의 급증에서 알 수 있듯이 분해능 혁명이후 11 cryoEM이 추진력을 얻었습니다 14. 시료 전처리, 이미징 및 데이터 처리 방법의 발전으로 인해 2010년에서 2020년 사이에 CryoEM을 사용하는 PDB(Protein Data Bank)14 증착의 수가 0.7%에서 17%로 증가했으며, 2020년에 보고된 구조의 약 50%가 3.5 Å 해상도 또는 그 이상의 해상도에서 측정되었습니다15,16. CryoEM은 유연하고 비결정성 생물학적 거대분자, 특히 막 단백질 및 다중 단백질 복합체를 거의 원자 분해능으로 연구할 수 있게 해주어 결정화 과정을 극복하고 XRD에 의한 고해상도 구조 측정에 필요한 회절이 잘 되는 결정을 얻을 수 있기 때문에 제약 산업을 포함한 구조 생물학 커뮤니티에서 빠르게 채택되고 있습니다.
CryoEM 맵에서 리간드를 정확하게 모델링하는 것은 분자 수준에서 단백질-리간드 복합체의 청사진 역할을 하기 때문에 매우 중요합니다. 리간드를 전자 밀도17,18,19,20에 맞추거나 구축하기 위해 리간드 밀도의 모양과 토폴로지에 의존하는 X선 결정학에 사용되는 몇 가지 자동화된 리간드 구축 도구가 있습니다. 그럼에도 불구하고, 해상도가 3 Å보다 낮으면, 이러한 접근법은 인식 및 구축을 위해 의존하는 위상학적 특징이 덜 정의되기 때문에 바람직하지 않은 결과를 생성하는 경향이 있습니다. 많은 경우에, 이러한 방법은 리간드를 CryoEM 맵으로 정확하게 모델링하는 데 효과적이지 않은 것으로 입증되었는데, 이는 이러한 맵이 일반적으로 3.5 Å-5 Å17 사이의 중저 분해능 범위에서 결정되었기 때문입니다.
CryoEM에 의한 단백질-리간드 복합체의 3D 구조 측정의 첫 번째 단계는 리간드를 단백질과 함께 공동 정제하거나(리간드가 단백질에 대한 결합 친화도가 높은 경우) 그리드 준비 전에 특정 기간 동안 단백질 용액을 리간드로 배양하는 것입니다. 그 후, 소량의 시료를 플라즈마로 세척된 구멍이 있는 TEM 그리드에 배치한 다음 액체 에탄에서 급속 동결하고 최종적으로 cryo-TEM으로 이미징합니다. 수십만 개에서 수백만 개의 개별 입자에서 얻은 2D 투영 이미지를 평균화하여 거대분자의 3차원(3D) 쿨롱 전위 맵을 재구성합니다. 이러한 맵에서 리간드와 용매 분자를 식별하고 모델링하는 것은 맵 전체의 이방성 분해능(즉, 분리능이 거대분자 전체에서 균일하지 않음), 리간드가 결합된 영역의 유연성 및 데이터의 노이즈로 인해 많은 경우에 심각한 문제를 제기합니다. XRD를 위해 개발된 많은 모델링, 개선 및 시각화 도구는 현재 동일한 목적으로 CryoEM에서 사용하도록 조정되고 있습니다 18,19,20,21. 이 기사에서는 현재 리간드를 식별하고, 모델을 구축하고, CryoEM에서 파생된 좌표를 미세 조정하는 데 사용되는 다양한 방법과 소프트웨어에 대한 개요를 제공합니다. 다양한 해상도와 복잡성을 가진 특정 단백질-리간드 복합체를 사용하여 리간드를 모델링하는 데 관련된 프로세스를 설명하기 위해 단계별 프로토콜이 제공되었습니다.
CryoEM 맵에서 리간드를 모델링하는 첫 번째 단계에는 맵에서 리간드 밀도(비단백질)를 식별하는 것이 포함됩니다. 리간드 결합이 단백질의 구조적 변화를 유발하지 않는 경우, 단백질-리간드 복합체와 apo-단백질 사이의 간단한 차이 맵을 계산하면 기본적으로 추가 밀도 영역이 강조되어 리간드의 존재를 암시합니다. 이러한 차이는 두 개의 맵만 필요하기 때문에 즉시 관찰할 수 있으며, 3D 정제 과정에서 중간 맵도 사용하여 리간드가 있는지 확인할 수 있습니다. 또한 분해능이 충분히 높으면(<3.0 Å) 차이 맵은 물 분자의 위치뿐만 아니라 리간드 및 단백질 잔류물과 상호 작용하는 이온에 대한 통찰력을 제공할 수도 있습니다.
apo-protein map이 없는 경우, 이제 독립형 도구로 사용할 수 있고 Refmac 개선의 일부로 CCP-EM 소프트웨어 제품군23,24에 통합되었으며 CCP4 8.0 릴리스 25,26에서도 Servalcat22를 사용할 수 있습니다. Servalcat을 사용하면 날카롭지 않은 half-map과 apoprotein 모델을 입력으로 사용하여 FSC 가중 차이(Fo-Fc) 맵을 계산할 수 있습니다. Fo-Fc 생략 맵은 실험 맵(Fo)과 모델에서 파생된 맵(Fc) 간의 차이를 나타냅니다. 모델에 리간드가 없는 경우, 실험적 EM 맵과 겹치는 Fo-Fc 맵의 양성 밀도는 일반적으로 리간드의 존재를 암시합니다. 여기서 가정은 단백질 사슬이 맵에 잘 맞고 나머지 양의 밀도가 리간드의 위치를 나타낸다는 것입니다. 그러나 양의 밀도가 단백질 곁사슬의 잘못된 로타머와 같은 모델링 부정확성에서 비롯된 것인지 여부를 꼼꼼하게 조사하는 것이 중요합니다.
두 번째 단계는 사용 가능한 화학 정보에서 잘 정의된 형상을 가진 리간드의 데카르트 좌표 파일을 얻거나 만드는 것입니다. CCP4 단량체 라이브러리에서 이미 사용할 수 있는 표준 리간드(예: ATP 및 NADP+)는 단량체 접근 코드를 통해 좌표 및 형상 파일을 검색하여 미세화에 사용할 수 있습니다. 그러나 알려지지 않았거나 비표준 리간드의 경우 다양한 도구를 사용하여 형상 파일을 생성할 수 있습니다. 일부 예로는 Phenix28의 eLBOW27 - (전자 리간드 빌더 및 최적화 워크벤치), Lidia - Coot29의 내장 도구, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Schrodinger 제품군 내 Glide의 Ligprep32-a 모듈이 있습니다. 그런 다음 리간드 좌표 파일은 실험용 cryoEM 맵과 Coot의 차이 맵에 의해 안내되는 밀도에 맞춰집니다. 그 다음에는 Phoenix28의 실제 공간 미세 조정 또는 Refmac33의 상호 미세 조정이 이어집니다. 좋은 그래픽 카드와 위에서 언급한 소프트웨어가 장착된 Linux 워크스테이션 또는 랩톱이 필요합니다. 이러한 프로그램의 대부분은 다양한 제품군에 포함되어 있습니다. CCP-EM24 및 Phoenix28은 교육용 사용자가 무료로 사용할 수 있으며 Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine 등 이 기사에서 사용되는 다양한 도구가 포함되어 있습니다. 마찬가지로 Chimera37 및 ChimeraX38은 교육용 사용자에게 무료 라이선스를 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CCP4-8.0</td>
			<td>Consortium of several institutes</td>
			<td>https://www.ccp4.ac.uk</td>
			<td>Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP-EM</td>
			<td>Consortium of several institutes</td>
			<td>https://www.ccpem.ac.uk/download.php</td>
			<td>Free for academic users and includes Coot, Relion and many others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot&#160;</td>
			<td>Paul Emsley, LMB, Cambridge</td>
			<td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
			<td>General software for model building but also available with other suites described above</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DockinMap (Phenix)</td>
			<td>Consortium of several institutes</td>
			<td>https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html</td>
			<td>Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Data Bank&#160;</td>
			<td>Consortium of several institutes</td>
			<td>https://www.ebi.ac.uk/emdb/</td>
			<td>Public Repository for Electron Microscopy maps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf</td>
			<td>Commercial, camera from Thermo Fisher&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix&#160;</td>
			<td>Consortium of several institutes</td>
			<td>https://phenix-online.org/download</td>
			<td>Free for academic users and includes Coot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Data Bank</td>
			<td>Consortium of several institutes</td>
			<td>https://rcsb.org</td>
			<td>Public database of macromolecular structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pymol</td>
			<td>Schrodinger</td>
			<td>https://pymol.org/2/</td>
			<td>Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relion</td>
			<td>MRC-LMB, Cambridge</td>
			<td>https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html</td>
			<td>Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&#38; 
			gad_source=1&#38;gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA 
			AkZesWC4FYQSwIQRk 
			ZApkj08MfYG040DtiiuL8 
			RihoCebEQAvD_BwE</td>
			<td>Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>UCSF, USA</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</td>
			<td>General purpose software for display, analysis and more</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera X</td>
			<td>UCSF, USA</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/</td>
			<td>General purpose software for display, analysis and more</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling ligands into maps derived from electron cryomicroscopy

고분자 복합체에서 단백질-리간드 상호 작용을 해독하는 것은 분자 메커니즘, 근본적인 생물학적 과정 및 약물 개발을 이해하는 데 매우 중요합니다. 최근 몇 년 동안 극저온 시료 전자 현미경(cryoEM)은 거대분자의 구조를 측정하고 원자 분해능에 가까운 리간드 결합 모드를 조사하는 강력한 기술로 부상했습니다. CryoEM 맵에서 비단백질 분자를 식별하고 모델링하는 것은 관심 분자 전체의 이방성 분해능과 데이터에 내재된 노이즈로 인해 종종 어렵습니다. 이 기사에서 독자들은 현재 리간드 식별, 모델 구축 및 선택된 거대분자를 사용한 원자 좌표 미세화에 사용되는 다양한 소프트웨어와 방법을 소개합니다. 에놀라아제 효소로 예시된 바와 같이 리간드의 존재를 식별하는 가장 간단한 방법 중 하나는 리간드가 있는 경우와 없는 상태에서 얻어진 두 개의 맵을 빼는 것입니다. 리간드의 추가 밀도는 더 높은 임계값에서도 차이 맵에서 두드러질 수 있습니다. 대사성 글루타메이트 수용체 mGlu5의 경우에서 볼 수 있듯이 이러한 간단한 차이 맵을 생성할 수 없는 경우가 있습니다. 최근에 도입된 Fo-Fc 생략 맵을 유도하는 방법은 리간드의 존재를 검증하고 입증하기 위한 도구 역할을 할 수 있습니다. 마지막으로, 잘 연구된 β-갈락토시다아제를 예로 들어 CryoEM 맵의 리간드 및 용매 분자 모델링에 대한 분리능의 효과를 분석하고 CryoEM이 약물 발견에 어떻게 사용될 수 있는지에 대한 전망을 제시합니다.

Cells accomplish their functions by carrying out innumerable chemical reactions simultaneously and independently, each meticulously regulated to ensure their survival and adaptability in response to environmental cues. This is achieved by molecular recognition, which enables biomolecules, especially proteins, to form transient or stable complexes with other macromolecules as well as small molecules or ligands1. Thus, protein-ligand interactions are fundamental to all processes in biology, which include the regulation of protein expression and activity, the recognition of substrates and cofactors by enzymes, as well as how cells perceive and relay signals1,2. A better understanding of the kinetic, thermodynamic, and structural properties of the protein-ligand complex reveals the molecular basis of ligand interaction and also facilitates rational drug design by optimizing drug interaction and specificity. An economical and faster approach to studying protein-ligand interaction is to use molecular docking, which is a computational method that virtually screens a diverse range of small molecules and predicts the binding mode and affinity of these ligands to target proteins3. However, experimental evidence from high-resolution structures determined by X-ray Diffraction (XRD), Nuclear Magnetic Resonance (NMR), or electron cryomicroscopy (cryoEM) provides the essential proof for such predictions and aids in the development of newer and more effective activators or inhibitors for a given target. This article uses the abbreviation &#39;cryoEM&#39; as the technique is commonly referred to. However, there is an ongoing debate on choosing the correct nomenclature, and recently, the term cryogenic-sample Electron Microscopy (cryoEM) has been proposed to indicate that the sample is at cryogenic temperature and imaged with electrons4. Similarly, the maps derived from cryoEM have been called electron potential, electrostatic potential, or Coulomb potential, and for simplicity, here we use cryoEM maps5,6,7,8,9,10.
Although XRD has been the gold standard technique in high-resolution structure determination of protein-ligand complexes, post resolution-revolution11 cryoEM has gained momentum, as indicated&#160;by the surge of Coulomb potential maps or cryoEM maps deposited in the Electron Microscopy Database (EMDB)12,13 over the last few years14. Owing to advancements in sample preparation, imaging, and data processing methods, the number of Protein Data Bank (PDB)14 depositions employing cryoEM increased from 0.7% to 17% between 2010 and 2020, with approximately 50% of reported structures in 2020 being determined at 3.5&#8197;&#197; resolution or better15,16. CryoEM has been rapidly adopted by the structural biology community, including the pharmaceutical industry, as it allows the study of flexible and non-crystalline biological macromolecules, especially membrane proteins and multi-protein complexes, at near-atomic resolution, overcoming the process of crystallization and obtaining well-diffracting crystals required for high-resolution structure determination by XRD.
Accurate modeling of the ligand in the cryoEM map is paramount, as it serves as a blueprint of the protein-ligand complex at a molecular level. There are several automated ligand-building tools used in X-ray crystallography&#160;that depend on the shape and topology of the ligand density in order to fit or build the ligand into the electron density17,18,19,20. Nevertheless, if the resolution is lower than 3 &#197;, these approaches tend to produce less desirable outcomes because the topological features on which they depend for recognition and building become less defined. In many instances, these methods have proven ineffective in accurately modeling ligands into cryoEM maps, as these maps have been determined in the low-to-medium resolution range, typically between 3.5 &#197;-5 &#197;17.
The first step in 3D structure determination of a protein-ligand complex by cryoEM involves either co-purifying the ligand with the protein (when the ligand has a high binding affinity to the protein) or incubating the protein solution with the ligand for a specific duration before grid preparation. Subsequently, a small sample volume is placed onto a plasma-cleaned holey TEM grid, followed by flash freezing in liquid ethane and ultimately imaging with a cryo-TEM. The 2D projection images from hundreds of thousands to millions of individual particles are averaged to reconstruct a 3-dimensional (3D) Coulomb potential map of the macromolecule. Identifying and modeling ligands and solvent molecules in these maps pose significant challenges in many cases due to the anisotropic resolution across the map (i.e., the resolution is not uniform across the macromolecule), flexibility in the region where the ligand is bound, and the noise in the data. Many of the modeling, refinement, and visualization tools that were developed for XRD are now being adapted for use in cryoEM for the same purposes18, 19, 20, 21. In this article, an overview of various methods and software currently used to identify ligands, build models, and refine the coordinates derived from cryoEM is presented. A step-by-step protocol has been provided to illustrate the processes involved in modeling ligands using specific protein-ligand complexes with varying resolution and complexity.
The first step in modeling ligands in cryoEM maps includes the identification of the ligand density (non-protein) in the map. If ligand binding does not induce any conformational change in the protein, then calculating a simple difference map between the protein-ligand complex and the apo-protein essentially highlights the regions of extra density, suggesting the presence of the ligand. Such differences can be observed immediately, as it just requires two maps, and even intermediate maps during the process of 3D refinement can be used to check if the ligand is present. Additionally, if the resolution is high enough (&#60;3.0 &#197;), then the difference map can also provide insights into the location of water molecules as well as ions interacting with the ligand and the protein residues.
In the absence of the apo-protein map, it is now possible to use Servalcat22, which is available as a standalone tool and has also been integrated into the CCP-EM software suite23,24 as part of the Refmac refinement and in CCP4 8.0 release25,26. Servalcat allows the calculation of an FSC weighted difference (Fo-Fc) map using the unsharpened half-maps and the apoprotein model as input. The Fo-Fc omit map represents the disparity between the experimental map (Fo) and the map derived from the model (Fc). In the absence of a ligand in the model, a positive density in a Fo-Fc map that overlaps with the experimental EM map typically suggests the presence of the ligand. The assumption here is that the protein chain is well-fitted in the map, and the remaining positive density indicates the location of the ligand. However, it is important to meticulously examine whether the positive density stems from modeling inaccuracies, such as the wrong rotamer of a protein side-chain.
The second step involves obtaining or creating a cartesian coordinate file of the ligand with well-defined geometry from the available chemical information. Standard ligands (for example, ATP and NADP+) that are already available in the CCP4 monomer library can be used for refinement by retrieving the coordinate and geometry files via their monomer accession code. However, for unknown or non-standard ligands, various tools are available to create the geometry files. Some of the examples include the eLBOW27 - (electronic ligand builder and optimization workbench) in Phenix28, Lidia - an in-built tool in Coot29, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32-a module of Glide within the Schrodinger suite. The ligand coordinate file is then fitted in the density, guided by both the experimental cryoEM map and the difference map in Coot. This is followed by real-space refinement in Phenix28 or reciprocal refinement in Refmac33. A Linux workstation or a laptop equipped with a good graphics card and the above-mentioned software is required. Most of these programs are included in various suites. CCP-EM24&#160;and Phenix28 are freely available to academic users and include a variety of tools that are used in this article, including Coot, Refmac533,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, etc. Similarly,&#160;Chimera37, and ChimeraX38 provide free licenses to academic users.

저자 스포트라이트: Cryo-EM 맵에서 리간드를 모델링하여 세포 프로세스 탐색

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy(전자 극저온 현미경에서 파생된 맵으로 리간드 모델링)

We are interested in understanding the physiological processes that occur across the cell, particularly at the membrane interface. We use Cryo-EM as a main technique and work on various interesting and challenging biological problems studying multiple macromolecular complexes. Determining the structures of membrane proteins and other labile complexes was challenging couple of decades ago.However, technical advances in Cryo-EM, a novel detergent and lipid mimetic and with endowments paved the way for rapid structure determination of these complexes. These structures can now be obtained at high resolution and potentially used in drug discovery. In single particle Cryo-EM, challenges include acquiring stable and homogeneous sample, embedding the sample in random orientation in thin ice, processing a large number of images with low signal to noise ratio, and accurately determining the angular orientation and classification during 3D reconstruction.Identifying and modeling small molecules in cryo-EM maps of ligand protein complexes is challenging due to inherent noise in the data and isotropic and low map resolution, sample heterogeneity, and ligand flexibility. This protocol is a step-by-step guide for identifying and modeling ligands and solvent molecules in low to medium resolution Cryo-EM.

예제 1 결핵균(M. tuberculosis)의 효소 에놀라아제는 해당작용의 끝에서 두 번째 단계를 촉매하고 2-포스포글리세레이트를 여러 대사 경로에 필수적인 중간체인 포스포에놀피루베이트(PEP)로 전환합니다44,45. apo-enolase 및 PEP-bound enolase 샘플에 대한 CryoEM 데이터는 1.07 Å의 동일한 픽셀 크기에서 수집되었으며 이미지 처리는 Relion 3.1<sup cla...

이 프로토콜은 거대분자의 CryoEM 맵에서 소분자 리간드를 모델링하는 데 사용할 수 있는 도구를 소개합니다.

Deciphering the protein-ligand interactions in a macromolecular complex is crucial for understanding the molecular mechanism, underlying biological ...

우리는 세포 전체, 특히 막 계면에서 발생하는 생리적 과정을 이해하는 데 관심이 있습니다. 우리는 Cryo-EM을 주요 기술로 사용하며 여러 고분자 복합체를 연구하는 다양하고 흥미롭고 도전적인 생물학적 문제를 연구합니다. 막 단백질 및 기타 불안정한 복합체의 구조를 결정하는 것은 수십 년 전만 해도 어려운 일이었습니다.그러나 새로운 세제 및 지질 모방제인 Cryo-EM의 기술 발전과 기부금은 이러한 복합체의 신속한 구조 측정을 위한 길을 열었습니다. 이러한 구조는 이제 고해상도로 얻을 수 있으며 잠재적으로 약물 발견에 사용할 수 있습니다. 단일 입자 Cryo-EM에서는 안정적이고 균일한 시료를 획득하고, 얇은 얼음에 무작위 방향으로 시료를 매립하고, 신호 대 노이즈 비율이 낮은 다수의 이미지를 처리하고, 3D 재구성 중 각도 방향 및 분류를 정확하게 결정하는 등의 과제가 있습니다.리간드 단백질 복합체의 Cryo-EM 맵에서 소분자를 식별하고 모델링하는 것은 데이터에 내재된 노이즈와 등방성 및 낮은 맵 해상도, 시료 이질성 및 리간드 유연성으로 인해 까다롭습니다. 이 프로토콜은 중저 분해능의 Cryo-EM에서 리간드 및 용매 분자를 식별하고 모델링하기 위한 단계별 가이드입니다.

modeling-ligands-into-maps-derived-from-electron-cryomicroscopy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy

795 조회수.  Tata Institute of Fundamental Research. 우리는 세포 전체, 특히 막 계면에서 발생하는 생리적 과정을 이해하는 데 관심이 있습니다. 우리는 Cryo-EM을 주요 기술로 사용하며 여러 고분자 복합체를 연구하는 다양하고 흥미롭고 도전적인 생물학적 문제를 연구합니다. 막 단백질 및 기타 불안정한 복합체의 구조를 결정하는 것은 수십 년 전만 해도 어려운 일이었습니다.그러나 새로운 세제 및 지질 모방제인 Cryo-EM?...