Para comenzar, descongele el reactivo de digestión celular enzimática a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Bajo un microscopio de campo claro con un aumento de 10x, observe los organoides intestinales humanos tridimensionales diferenciados para garantizar la salud celular. Reemplace los medios de los pocillos de una placa de 24 pocillos que contiene organoides diferenciados con 500 microlitros de solución de recuperación de celdas frías.
Pipetea hacia arriba y hacia abajo para liberar las células de la membrana basal. Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Incube el tubo en hielo durante 10 minutos, pipeteando hacia arriba y hacia abajo cada cinco minutos.
Centrifugar la suspensión celular a 400 g durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante del tubo sin alterar el pellet. Vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de reactivo de digestión celular enzimática precalentado, pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces.
Coloque los organoides durante 30 minutos a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono. Cada 10 minutos, pipetee todo el volumen 10 veces con una pipeta P1000 para ayudar a disociar las células. Centrifugar la suspensión celular a 400 g durante tres minutos a cuatro grados centígrados y resuspender el pellet en un mililitro de medio de diferenciación.
Pipetea rápidamente las células hacia arriba y hacia abajo 50 veces en hielo para disociar los organoides en células individuales. Filtre todo el volumen a través de un colador de punta de 70 micras y recoja el eluido en un tubo nuevo de 1,5 mililitros. A continuación, filtre el eluido obtenido a través de un colador de 70 micras en un colador de punta de 40 micras.
Agregue cinco microlitros de azul de tripán al 0,4 % a cinco microlitros de suspensión celular y cuente las células individuales viables con exclusión de azul de tripano. Diluir la muestra con medios de cultivo celular para obtener 1000 células por microlitro. Se aislaron un total de 4.402 células individuales a partir de organoides intestinales tridimensionales tridimensionales ileales diferenciados, que representan los tipos de células esperados, incluidos los enterocitos absorbentes y las células secretoras.
