Preparación de suspensiones unicelulares a partir de organoides intestinales humanos diferenciados como monocapas de 96 pocillos

Para comenzar, prepare el reactivo de digestión de células enzimáticas y PBS / EDTA para la digestión de organoides intestinales humanos. Bajo un microscopio de campo claro, confirme el crecimiento de organoides intestinales humanos tridimensionales diferenciados como monocapas. Deseche los medios de cultivo celular del cultivo monocapa y reemplácelos con 100 microlitros de PBS/EDTA.

Después de eliminar PBS/EDTA, agregue 100 microlitros de reactivo de digestión enzimática tibia a cada pocillo. Coloque la placa a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5% y pipetee todo el volumen cinco veces cada 10 minutos durante 20 a 30 minutos. Transfiera uno a dos microlitros de suspensión celular a un portaobjetos de vidrio cada 10 minutos para evaluar la disociación observando el porcentaje de células individuales.

Después de la disociación, combine tres pocillos replicados por condición en un solo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Añadir 700 microlitros de medio de diferenciación de cultivo celular que contenga 10 micromolares inhibidores de ROCK, y mezclar suavemente mediante pipeteo. Filtre todo el volumen a través de un colador de punta de 70 micras, recogiendo el flujo en un tubo nuevo de 1,5 mililitros.

Filtre el flujo obtenido a través de un colador de 70 micras en un colador de punta de 40 micras. Agregue cinco microlitros de azul de tripán al 0,4% a cinco microlitros de suspensión celular y cuente las células individuales viables. Diluir la muestra con medios de cultivo celular que contengan inhibidor de ROCK para obtener 1.000 células por microlitro.

Se aislaron un total de 9.952 células individuales de organoides intestinales humanos diferenciados cultivados en placas de 96 pocillos.