Los autores reconocen las subvenciones U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, U19 AI116497 y el Aviso de Acuerdo de Cooperación de la NASA/TRISH NNX16AO69A.

Las líneas de organoides utilizadas aquí se obtuvieron del Centro de Enfermedades Digestivas GEMS Core del Centro Médico de Texas. Brevemente, para establecer inicialmente líneas de organoides, las muestras de tejido del donante se lavaron y se digierieron enzimáticamente para liberar las criptas intestinales. Las criptas se incrustaron en una membrana basal y se cultivaron en un medio. La Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de Baylor aprobó el protocolo del estudio para obtener muestras de tejido a partir de las cuales se establecieron líneas de organoides, y se obtuvo el consentimiento informado de todos los donantes para establecer líneas de organoides a partir del tejido donado.
1. Aprobación de las OHIO 3D para expandirlas y diferenciarlas
<ol><li>Retire y deseche el medio de los pocillos de organoides cultivados en placas de 24 pocillos (alrededor de la membrana basal sólida) con una pipeta P1000. Añada 300 μL de tripsina-EDTA al 0,05% al pocillo y rompa mecánicamente los organoides pipeteando con una pipeta P1000 hacia arriba y hacia abajo 5 veces.</li>
	<li>Incubar la placa a 37 °C durante 4 min. Agregue 500 μL de medio completo sin factores de crecimiento (medio CMGF) con 10% de FBS a cada pocillo (Tabla 1). Utilice una pipeta P1000 y una mezcla de medio CMGF y HIO, 10 veces hacia adelante y hacia atrás en el pocillo. Transfiera todo el volumen a un tubo de 15 ml. Combine el paso de varios pocillos en el mismo tubo de 15 ml. No combine más de 10 pocillos por tubo.</li>
	<li>Centrifugar las celdas a 4 °C con una centrífuga de rotor oscilante a 100 x g durante 5 min. Retire todo el medio, manteniendo el pellet en el fondo del tubo. Mantenga el tubo en hielo.</li>
	<li>Calcule la cantidad de membrana basal necesaria para el número de placas de HIO y vuelva a suspender el pellet de HIO en 30 μL/pocillo de membrana basal utilizando puntas de pipeta P200 frías. Pipetee la mezcla de membrana basal HIO como una gota en el centro de una placa de 24 pocillos con puntas de pipeta P200 frías.</li>
	<li>Transfiera la placa a una incubadora a 37 °C. Deje que la membrana basal se solidifique durante 5-10 minutos, luego agregue 500 μL de medio completo a temperatura ambiente que contenga WNT, R-espondina, noggin, EGF e inhibidor de ROCK (WRNE+Y; Tabla 1) a cada pocillo y cultivo en una incubadora a 37 °C. Actualice la cultura con WRNE+Y cada dos días durante 7 días. NOTA: Un HIO sano tendrá forma quística con un epitelio brillante en ciernes (Figura 2). Las células en el centro del quiste no se pueden visualizar. Un HIO poco saludable se verá opaco y tendrá un epitelio grueso con un centro sólido. La característica más importante es la apariencia brillante.</li>
</ol>2. Diferenciación HIO: formato 3D
<ol><li>Utilice un pocillo de HIOs 3D para 3 pocillos de HIOs diferenciados 3D 1 semana después del cultivo.</li>
	<li>Retire los medios de los pozos. Disperse la membrana basal y las OHIO con una pipeta P1000 y agregue 500 μL fríos de CMGF- por pocillo y pipete hacia arriba y hacia abajo al menos 5 veces. Centrifugar las HIO a 4 °C con una centrífuga de rotor oscilante a 100 x g durante 5 min. Retire todo el medio manteniendo el pellet en el fondo del tubo.</li>
	<li>Agregue 30 μL de membrana basal por pocillo de HIO que se esté plateando. Pipetear la gota de 30 μL de membrana basal con OHIO en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Incubar a 37 °C durante 10 min. Añada 500 μL de medios WRNE+Y/Diff (50/50).</li>
	<li>Cambie el medio a medio de diferenciación después de 24 h durante 3 días adicionales, actualizando el medio cada dos días. Prepare 3 pocillos por muestra para agrupar para reducir la variabilidad técnica.</li>
</ol>3. Diferenciación HIO: Formato monocapa
<ol><li>Cubra los insertos o pocillos de cultivo celular de membrana de una placa de 96 pocillos con 100 μL/pocillo de colágeno placentario humano IV (1 mg/ml en ácido acético 100 mM) diluido en H2O frío (1:30). Incubar a 37 °C durante un mínimo de 1,5 h o un máximo durante la noche. Para el inserto de cultivo celular de membrana, agregue H2O estéril en el espacio de la placa para humidificar la placa; para la placa de 96 pocillos, agregue H2O estéril en los pocillos no utilizados.</li>
	<li>Recoja HIOs 3D cultivadas en WRNE durante 7 días retirando el medio y recuperando la membrana basal y las células añadiendo 500 μL/pocillo de EDTA 0,5 mM frío (EDTA 0,5 M diluido 1:1000 en PBS estéril). Utilice una pipeta P1000 para pipetear organoides y soluciones hacia arriba y hacia abajo 5 veces y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga de 15 ml. No acumule más de 10 pocillos de organoides por tubo. Centrifugar durante 5 min a 300 x g en un rotor de cubo oscilante a 4 °C. NOTA: Para preparar 3 pocillos en una placa de 96 pocillos, use 1 pocillo de OHIO 3D. Para preparar 1 inserto de cultivo celular de membrana, use 1 pocillo de OHIO 3D (la densidad de siembra de células individuales es de aproximadamente 1-2 x 105 células/pocillo para placa de 96 pocillos, 2,5-3 x 105 células/pocillo para el inserto de cultivo celular de membrana).</li>
	<li>Retire 500 μL de medio, dejando el pellet en el fondo del tubo. Disociar las HIOs añadiendo 500 μL de tripsina al 0,05%/EDTA al 0,5 mM e incubar durante 4-5 min a 37 °C. Pipetea vigorosamente hacia arriba y hacia abajo durante ~50x con un P1000. Evite hacer burbujas pipeteando contra el costado del tubo.</li>
	<li>Inactive la tripsina añadiendo 1 mL de CMGF- que contiene un 10% de FBS. Filtre los grandes grupos de células no digeridas humedeciendo un filtro de células de 40 μm con 1 ml de CMGF que contiene un 10% de FBS y agregando las células a la parte superior del filtro de células. Use la gravedad para permitir que las células pasen a través del filtro y deseche el filtro de células que contiene grupos de células.</li>
	<li>Recoja las células por centrifugación durante 5 min a 400 x g en un rotor de cubo oscilante a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire el líquido del inserto de cultivo celular de membrana recubierto de colágeno o de la placa de 96 pocillos. Vuelva a suspender el pellet de HIO en 100 μL/pocillo de WRNE que contenga 10 μM de Y-27632 y, a continuación, pipetee en el compartimento superior del inserto de cultivo celular de membrana o en la placa de 96 pocillos. Para el inserto de cultivo celular de membrana, agregue 600 μL de WRNE que contenga 10 μM Y-27632 en el compartimiento inferior del pocillo.</li>
	<li>Retire el medio después de 24 h de la parte superior e inferior del inserto de cultivo celular de membrana o de la placa de 96 pocillos y reemplácelo con medio de diferenciación durante 5 días. Prepare 3 pocillos por muestra para agrupar para reducir la variabilidad técnica.</li>
</ol>4. Preparación de suspensiones unicelulares a partir de HIOs 3D diferenciadas para transcriptómica unicelular
<ol><li>Coloque el reactivo de digestión celular enzimática a 37 °C en una incubadora de CO2 para descongelar y calentar 30 minutos antes de iniciar la digestión HIO 3D. Verifique las OHIO con un microscopio de campo brillante a 10x para garantizar la salud celular.</li>
	<li>Retire los medios de los pocillos y agregue 500 μL de solución de recuperación de celda fría a los pocillos. Pipetea hacia arriba y hacia abajo varias veces para liberar las células de la membrana basal con una pipeta P1000 y puntas de pipeta estándar. Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. NOTA: El uso de pocillos replicados garantiza un número adecuado de células y reduce la variación entre pocillos. No combine los pozos antes del paso 4.7 a continuación.</li>
	<li>Incube los tubos de células en hielo durante 10 minutos, pipeteando hacia arriba y hacia abajo cada 5 minutos. Recoja las células por centrifugación durante 3 min a 400 x g a 4 °C.</li>
	<li>Retire el líquido del tubo, teniendo cuidado de no alterar el pellet celular. Resuspender las células en 500 μL de reactivo de digestión celular enzimática precalentado. Pipetea hacia arriba y hacia abajo con un P1000 al menos 10x.</li>
	<li>Incubar las HIOs durante 30 min a 37 °C en una incubadora deCO2 . Cada 10 minutos, pipetee todo el volumen 10 veces con una pipeta P1000 para ayudar a disociar las células. Evite introducir burbujas de aire en la suspensión de la celda.</li>
	<li>Granular las células durante 3 min a 400 x g a 4 °C. Retire el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 1 ml de medio de diferenciación y almacene en hielo. NOTA: A partir de este momento, las OHIO deben mantenerse siempre en hielo.</li>
	<li>Pipetea las células hacia arriba y hacia abajo 50 veces rápidamente con un P1000 para garantizar que las OHIO se disocien en células individuales. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire en este paso, ya que provocará la pérdida de células.</li>
	<li>Filtre todo el volumen a través de un colador de punta de 70 μm con una punta de pipeta P1000. Utilice un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para recoger el eluido. NOTA: La punta del filtro no se obstruirá si el tiempo de digestión es suficiente. Utilice varias puntas de filtro si el filtro se obstruye; No fuerce el volumen a través del filtro.</li>
	<li>Repita el paso 4.8 con un colador de punta de 40 μm. Guarde las muestras en hielo.</li>
	<li>Cuente células individuales viables en una cámara de recuento de células utilizando la exclusión de azul de tripano añadiendo 5 μL de azul de tripano al 0,4% a 5 μL de suspensión celular. Diluya la muestra según sea necesario hasta 1000 células/μL. Si la densidad celular es inferior a 1000 células/μL, granule las células durante 2 min a 400 x g a 4 °C, retire el medio original y vuelva a suspenderlo en el medio de cultivo celular. Este protocolo suele producir 5 x 105-1 x 106 celdas. NOTA: La preparación de una suspensión de alta calidad (90% viable y 90% de células individuales) es esencial para obtener datos de una sola célula de alta calidad. Sin embargo, la experiencia indica que se puede aceptar una viabilidad tan baja como el 75% en los casos en que el tratamiento, como la infección o la aplicación de moléculas pequeñas, afecta la viabilidad.</li>
	<li>Prepare bibliotecas de ADN para plataformas de perfiles transcripcionales de células individuales de acuerdo con los protocolos del fabricante. Procesar los datos de acuerdo con los protocolos de mejores prácticas para el análisis de datos scRNAseq13,14.</li>
</ol>5. Preparación de suspensiones unicelulares a partir de HIOs diferenciadas en un inserto de cultivo celular de membrana
<ol><li>Coloque el reactivo de digestión celular enzimática a 37 °C en una incubadora de CO2 para descongelar y calentar 30 min antes de iniciar la digestión del inserto de cultivo celular de membrana HIO. Divida el reactivo de digestión celular enzimática precalentado en alícuotas de 200 μL en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, 1 tubo por inserto de cultivo celular de membrana. Mantenga los tubos en la incubadora a 37 °C hasta que estén listos para su uso.</li>
	<li>Prepare PBS-EDTA añadiendo 5 μL de EDTA 0,5 M a 5 mL de PBS. Alícuota 500 μL de PBS-EDTA en una placa de 24 pocillos, 1 pocillo por inserto de cultivo celular de membrana.</li>
	<li>Lavar las células con PBS-EDTA: transferir los insertos de cultivo celular de membrana de los pocillos que contienen medios de crecimiento a los pocillos que contienen PBS-EDTA. Retire el medio de cultivo celular del lado apical y reemplácelo con 100 μL de PBS-EDTA. Tenga cuidado de no alterar la capa celular.</li>
	<li>Deseche inmediatamente el PBS-EDTA añadido a la cara apical de los insertos de cultivo celular de membrana. Retire el inserto de cultivo celular de membrana del pocillo, séquelo tocando suavemente el borde con una toalla de papel y luego inviértalo en la mesa de trabajo. Utilice una hoja de bisturí afilada para quitar la membrana del inserto cortando alrededor de la circunferencia interior de la membrana. Trabaje rápidamente para evitar que se seque.</li>
	<li>Utilice pinzas para transferir la membrana al tubo de microcentrífuga precalentado de 1,5 ml lleno de reactivo de digestión celular enzimática y asegúrese de que la membrana esté completamente sumergida. Repita el procedimiento para todos los insertos adicionales de cultivo celular de membrana. NOTA: Aumentar el volumen del reactivo de digestión celular enzimática a 500 μL puede ayudar a disociar monocapas densas.</li>
	<li>Disociar las células incubando tubos con membranas a 37 °C en una incubadora de CO2 . Mezcle pipeteando suavemente todo el volumen 5x con una pipeta de 200 μL cada 10 minutos durante un total de 30 minutos. Evite las burbujas y la succión de la membrana para preservar la viabilidad.</li>
	<li>Transfiera una pequeña alícuota de células (1-2 μL) a un portaobjetos de vidrio cada 10 minutos para evaluar la disociación mediante la evaluación cualitativa del porcentaje de células individuales. Con un pipeteo adicional, puede llevar hasta 50 minutos lograr un 80%-90% de células individuales, dependiendo del tipo de HIO. Raspe suavemente la membrana con la punta de una pipeta durante los pasos de mezcla para fomentar la disociación, especialmente en el caso de las células difíciles de disociar, sin embargo, el raspado puede afectar la viabilidad.</li>
	<li>Combine 3 pocillos replicados por condición en un solo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (600 μL en total). Añadir 400 μL de medio de cultivo celular (diff) + 10 μM de ROCKi (1 mL de volumen total). Mezclar suavemente pipeteando. NOTA: El uso de pocillos replicados garantiza un número adecuado de células y reduce la variación entre pocillos. Los pozos deben agruparse en este paso.</li>
	<li>Filtre todo el volumen a través de un colador de punta de 70 μm con una punta de pipeta de 1 mL. Recoja el flujo en un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 mL. NOTA: La punta del filtro no se obstruirá si el tiempo de digestión es suficiente. Utilice varias puntas de filtro si el filtro se obstruye; No fuerce el volumen.</li>
	<li>Repita el paso 5.9 con un colador de punta de 40 μm. Guarde las muestras en hielo.</li>
	<li>Cuente células individuales viables en una cámara de recuento de células utilizando la exclusión de azul de tripano añadiendo 5 μL de azul de tripano al 0,4% a 5 μL de suspensión celular. Diluya la muestra según sea necesario hasta 1000 células/μL. Si la densidad celular es inferior a 1000 células/μL, centrifugar 2 min a 400 x g a 4 °C para granular las células, retirar el medio original y volver a suspender en WRNE+Y a la densidad celular deseada. Este protocolo suele producir 4 x 105 - 6 x 105 celdas. NOTA: La preparación de una suspensión de alta calidad (90% de células viables y 90% de células individuales) es esencial para obtener datos de una sola célula de alta calidad. Sin embargo, la experiencia indica que se puede aceptar una viabilidad tan baja como el 75% en los casos en que el tratamiento, como la infección o la aplicación de moléculas pequeñas, afecta la viabilidad.</li>
	<li>Preparar bibliotecas de ADN para las plataformas de perfiles transcripcionales de células individuales de acuerdo con los protocolos del fabricante. Procesar los datos de acuerdo con los protocolos de mejores prácticas para el análisis de datos scRNAseq13,14.</li>
</ol>6. Preparación de suspensiones unicelulares a partir de HIOs diferenciadas como monocapas de 96 pocillos
<ol><li>Coloque el reactivo de digestión celular enzimática a 37 °C en una incubadora de CO2 para descongelar y calentar 30 minutos antes de iniciar la digestión de HIO monocapa.</li>
	<li>Prepare PBS-EDTA añadiendo 5 μL de EDTA 0,5 M a 5 mL de PBS. Deseche los medios de cultivo celular de la placa de 96 pocillos y reemplácelos con 100 μL de PBS-EDTA. Tenga cuidado de no alterar la capa celular.</li>
	<li>Disociar las células: Deseche el PBS-EDTA y agregue 100 μL de reactivo de digestión enzimática tibia a cada pocillo. Coloque la placa a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% y mezcle pipeteando suavemente todo el volumen 5x con una punta de pipeta de 200 μL cada 10 min durante 20-30 min. Evite las burbujas para preservar la viabilidad. NOTA: Aumentar el volumen del reactivo de digestión celular enzimática a 500 μL puede ayudar a disociar monocapas densas.</li>
	<li>Transfiera una pequeña alícuota de células (1-2 μL) a un portaobjetos de vidrio cada 10 minutos para evaluar la disociación. Puede llevar hasta 50 minutos lograr un 80%-90% de células individuales, dependiendo del tipo de HIO. Raspe suavemente la placa con la punta de una pipeta durante los pasos de mezcla para estimular la disociación, especialmente para las células difíciles de disociar; Sin embargo, el raspado puede afectar la viabilidad.</li>
	<li>Combine 3 pocillos replicados por condición en un solo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (300 μL en total). Añadir 700 μL de medio de cultivo celular (diff) + 10 uM de ROCKi (1 mL de volumen total). Mezclar suavemente pipeteando. NOTA: El uso de pocillos cultivados replicados garantiza un número adecuado de células y reduce la variación de pocillo a pocillo.</li>
	<li>Filtre todo el volumen a través de un colador de punta de 70 μm con una punta de pipeta de 1 mL. Recoja el flujo en un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 mL. NOTA: La punta del filtro no se obstruirá si el tiempo de digestión del reactivo de digestión de células enzimáticas es suficiente. Utilice varias puntas de filtro si el filtro se obstruye; No fuerce el volumen.</li>
	<li>Repita el paso 6.6 con un colador de punta de 40 μm. Guarde las muestras en hielo.</li>
	<li>Cuente células individuales viables en una cámara de recuento de células utilizando la exclusión de azul de tripano añadiendo 5 μL de azul de tripano al 0,4% a 5 μL de suspensión celular. Diluir según sea necesario hasta 1000 células/μL. Si la densidad celular es inferior a 1000 células/μL, centrifugar 2 min a 400 x g 4 °C para granular las células, retire el medio original y vuelva a suspender en el medio de cultivo celular + ROCKi a la densidad celular deseada. Este protocolo suele producir 2 x 105 - 6 x 105 celdas. NOTA: La preparación de una suspensión de alta calidad (90% de células viables y 90% de células individuales) es esencial para obtener datos de una sola célula de alta calidad. Sin embargo, la experiencia indica que se puede aceptar una viabilidad tan baja como el 75% en los casos en que el tratamiento, como la infección o la aplicación de moléculas pequeñas, afecta la viabilidad.</li>
	<li>Prepare bibliotecas de ADN de acuerdo con los protocolos del fabricante de la plataforma de perfiles transcripcionales de células individuales. Procesar los datos de acuerdo con los protocolos de mejores prácticas para el análisis de datos scRNAseq13,14.</li>
</ol>

Integración de la transcriptómica unicelular con organoides intestinales humanos

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+microphysiological+systems.">Gastrointestinal microphysiological systems.</a> Exp Biol Med. 242 (16), 1633-1642 (2017).</li><li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays.">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li><li>Elmentaite, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+the+human+intestinal+tract+mapped+across+space+and+time.">Cells of the human intestinal tract mapped across space and time.</a> Nature. 597 (7875), 250-255 (2021).</li><li>Hickey, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gastrointestinal+epithelia+of+the+esophagus,+stomach,+and+duodenum+resolved+at+single-cell+resolution.">Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution.</a> Cell Rep. 34 (10), 108819 (2021).</li><li>Luecken, M. D., Theis, F. 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Los autores no tienen conflictos de intereses.

Mediante el uso de plataformas genómicas unicelulares, los sistemas biológicos complejos, como los cultivos de HIO derivados de tejidos que modelan el epitelio intestinal, se pueden descomponer para producir contribuciones celulares individuales a la respuesta biológica general 4,5,6. La heterogeneidad celular y las poblaciones de células raras también pueden ser identificadas e interrogadas. La entrada celular debe optimiz...

El epitelio del intestino delgado tiene dos zonas distintas: la cripta que alberga la célula madre intestinal (ISC) y las vellosidades, que está compuesta por células diferenciadas de los linajes secretor y absorbente. A esta complejidad se suma la especificidad regional del epitelio que proporciona propiedades funcionales únicas entre las regiones del intestino delgado. Un trabajo pionero estableció las condiciones de cultivo en las que tanto la cripta del intestino delgado humano como las zonas de vellosidades pueden generarse ex vivo a partir de tejidos quirúrgicos o biopsias de tejido1. Estos cultivos están cerrando la brecha entre los estudios en animales y los ensayos clínicos y están revelando la biología celular, la bioquímica y la fisiología del tracto gastrointestinal no reconocidas anteriormente. Las HIOs se propagan como estructuras esféricas 3D utilizando un medio con factores de crecimiento que promueven la viabilidad de las células madre y matrices de soporte extracelular. Estas condiciones dan como resultado un modelo de HIO similar a una cripta que consta principalmente de progenitores y células madre. La eliminación de los factores de crecimiento promueve la diferenciación de ISC (modelo similar a vellosidades) y la producción de células epiteliales intestinales maduras (cáliz, enteroendocrino, penacho, enterocito) en proporciones apropiadas junto con la proliferación y diferenciación celular, la polarización, la integridad de la barrera, las características específicas regionales y las respuestas fisiológicas apropiadas2. Los cultivos de HIO son genéticamente estables y pueden propagarse indefinidamente en su estado similar a una cripta. El fácil acceso a la superficie apical de estos cultivos es proporcionado por las condiciones de cultivo que permiten el crecimiento en un formato monocapa3. Las HIO también permiten incluir en los análisis biológicos consideraciones sobre la variabilidad individual del huésped, como la genética, la edad, el sexo, el origen étnico y el estado de la enfermedad. Las herramientas de evaluación analítica y funcional son idénticas a las utilizadas en los enfoques centrados en líneas celulares transformadas e incluyen una variedad de técnicas moleculares como la citometría de flujo, la microscopía, la transcriptómica, la proteómica y la metabolómica.
La transcriptómica de células individuales está revolucionando nuestra comprensión de la biología y la fisiología del intestino delgado al proporcionar información sobre las contribuciones individuales de cada tipo de célula a un proceso biológico. El trabajo pionero con esta tecnología ha proporcionado un panorama de los tipos de células presentes en el intestino humano nativo 4,5,6. Las plataformas de perfiles transcripcionales de células individuales permiten explorar el panorama transcripcional de células individuales, lo que permite que la heterogeneidad celular pase a primer plano en la exploración científica. En algunas plataformas de perfiles transcripcionales de una sola célula, la partición microfluídica y el código de barras se utilizan para generar bibliotecas de ADNc a partir de ARNm celulares poliadenilados obtenidos de hasta 10.000 células por muestra. En esta plataforma, las gotas que contienen células individuales, oligonucleótidos con código de barras, reactivos de transcripción inversa y aceite forman una vesícula de reacción que da como resultado que todos los ADNc de una sola célula tengan el mismo código de barras. A continuación, los ADNc con códigos de barras se pueden secuenciar de forma eficiente mediante la secuenciación de última generación. Los datos generados se pueden manejar a través de software y herramientas de visualización, que convierten las secuencias con códigos de barras en mapas de visualización y perfiles transcripcionales de una sola célula. Las poblaciones celulares pueden identificarse utilizando bases de datos disponibles públicamente del epitelio del intestino delgado humano 4,5,6. Aunque muchos estudios han utilizado esta plataforma para interrogar organoides intestinales murinos a nivel de una sola célula, el análisis de las respuestas transcripcionales de una sola célula de las HIO se ha quedado atrás 7,8,9,10,11,12.
Aquí, proporcionamos una guía paso a paso para aislar células viables de OHIO del intestino delgado para su procesamiento en plataformas de perfiles transcripcionales de células individuales (Figura 1). Proporcionamos pautas de cultivo y diferenciación junto con componentes de medios que se han optimizado para la diferenciación epitelial. Describimos métodos de recuperación celular para tres formatos de cultivo diferentes: cultivos tridimensionales (3D) y monocapa, ya sea en plástico o en insertos de cultivo celular de membrana. Proporcionamos datos de agrupamiento de muestras obtenidos mediante software de código abierto para derivar genes expresados diferencialmente en cada clúster.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS Ca- Mg-</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Nunclon delta surface tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Flowmi tip strainer</td>
			<td>SP Bel-Art Labware</td>
			<td>H13680-0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Flowmi tip strainer</td>
			<td>SP Bel-Art Labware</td>
			<td>H13680-0070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#8217; GEM, Library &#38; Gel Bead Kit v3.1</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5533-5MG</td>
			<td>33 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Recovery Solution&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Mg2-, Ca2-)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN conditioned media</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, GFR, phenol free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse recombinant EGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>500 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72308</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using human intestinal organoids to understand the small intestine epithelium at the single cell transcriptional level

La transcriptómica de células individuales ha revolucionado nuestra comprensión de la biología celular del cuerpo humano. Los cultivos de organoides del intestino delgado humano de última generación proporcionan sistemas modelo ex vivo que cierran la brecha entre los modelos animales y los estudios clínicos. La aplicación de la transcriptómica de células individuales a modelos de organoides intestinales humanos (HIO) está revelando la biología celular, la bioquímica y la fisiología del tracto gastrointestinal no reconocidas anteriormente. Las plataformas avanzadas de transcriptómica de células individuales utilizan particiones microfluídicas y códigos de barras para generar bibliotecas de ADNc. Estos ADNc con códigos de barras pueden ser fácilmente secuenciados por plataformas de secuenciación de próxima generación y utilizados por varias herramientas de visualización para generar mapas. Aquí, describimos métodos para cultivar y diferenciar HIOs de intestino delgado humano en diferentes formatos y procedimientos para aislar células viables de estos formatos que son adecuados para su uso en plataformas de perfiles transcripcionales de una sola célula. Estos protocolos y procedimientos facilitan el uso de HIOs del intestino delgado para obtener una mayor comprensión de la respuesta celular del epitelio intestinal humano a nivel transcripcional en el contexto de una variedad de entornos diferentes.

The small intestinal epithelium has two distinct zones: the crypt that houses the intestinal stem cell (ISC) and the villus, which is comprised of differentiated cells of the secretory and absorptive lineages. Adding to this complexity is the regional specificity of the epithelium that provides unique functional properties between the regions of the small intestine. Pioneering work established culture conditions in which both the human small intestinal crypt and villus zones can be generated ex vivo from surgical tissues or tissue biopsies1. These cultures are bridging the gap between animal studies and clinical trials and are revealing previously unrecognized cell biology, biochemistry, and physiology of the gastrointestinal tract. The HIOs are propagated as 3D spherical structures using a media with growth factors that promote stem cell viability and extracellular support matrices. These conditions result in a crypt-like HIO model that consists mostly of progenitors and stem cells. Removal of the growth factors promotes ISC differentiation (villus-like model) and production of mature intestinal epithelial cells (goblet, enteroendocrine, tuft, enterocyte) in appropriate ratios along with cell proliferation and differentiation, polarization, barrier integrity, regional specific features, and appropriate physiological responses2. HIO cultures are genetically stable and can be propagated indefinitely in their crypt-like state. Easy access to the apical surface of these cultures is provided by culture conditions that allow growth in a monolayer format3. HIOs also allow considerations of host individual variability such as genetics, age, sex, ethnicity, and disease status to be included in biological analyses. Analytic and functional assessment tools are identical to those used in approaches centered on transformed cell lines and include a variety of molecular techniques such as flow cytometry, microscopy, transcriptomics, proteomics, and metabolomics.
Single cell transcriptomics is revolutionizing our understanding of the biology and physiology of the small intestine by providing insight into the individual contributions of each cell type to a biological process. Pioneering work using this technology has provided a landscape of the cell types present in the native human intestine4,5,6. Single cell transcriptional profiling platforms allow exploration of the transcriptional landscape of individual cells, allowing cell heterogeneity to come to the forefront of scientific exploration. In some single cell transcriptional profiling platforms, microfluidic partitioning and barcoding are used to generate cDNA libraries from cellular polyadenylated mRNAs obtained from up to 10,000 cells per sample. On this platform, droplets containing single cells, barcoded oligonucleotides, reverse transcription reagents, and oil form a reaction vesicle that results in all cDNAs from a single cell having the same barcode. The barcoded cDNAs can then be efficiently sequenced using next generation sequencing. Data generated can be handled through software and visualization tools, which convert the barcoded sequences into visualization maps and single cell transcriptional profiles. Cell populations can be identified using publicly available databases of human small intestinal epithelium4,5,6. Although many studies have utilized this platform to interrogate murine intestinal organoids at the single cell level, the analysis of single cell transcriptional responses of HIOs has lagged behind7,8,9,10,11,12.
Here, we provide a step-by-step guide to isolating viable cells from small intestinal HIOs for processing on single cell transcriptional profiling platforms (Figure 1). We provide culturing and differentiation guidelines along with media components that have been optimized for epithelial differentiation. We outline cell recovery methods for three different culture formats: three dimensional (3D) and monolayer cultures either on plastic or on membrane cell culture inserts. We provide sample clustering data obtained using open-source software to derive differentially expressed genes in each cluster.

Autor destacado: Integración de la transcriptómica unicelular con cultivos de organoides para una investigación avanzada y conocimientos terapéuticos

Uso de organoides intestinales humanos para comprender el epitelio del intestino delgado a nivel transcripcional de una sola célula

We are integrating single-cell transcriptomics and organoid technology to better understand the biology of the small intestine. These technologies are allowing us deeper insight into the cellular heterogeneity that exists within that tissue. The tools that improve the throughput, sensitivity, and the resolutions are the keys that advanced research in the field.Some examples are improved computational methods and the technological innovations. Cost reductions also a major focus. The process of preparing and sequencing the libraries of samples can cause transcription variations, which is one challenge.For organoids, specific challenges include limited spatial context or information about temporal dynamics. Single-cell analysis of the human intestinal organoids provides previously unattainable information into the cell types that make up the intestinal epithelium. This, thereby, opens the window to the transcriptional landscape of those cells.We are using these technologies to identify biomarkers and mechanisms of human intestinal diseases. These biomarkers and mechanisms will advance our ability to utilize personalized medicine-based approaches to treat human disease and improve human health overall.

Las suspensiones unicelulares se agruparon a partir de 2-3 pocillos de inserto de cultivo celular de membrana, monocapa y OHIO 3D para garantizar un rendimiento celular suficiente y reducir la variación de pocillo a pocillo. Las bibliotecas de células individuales se prepararon utilizando reactivos específicos para la plataforma de perfiles transcripcionales de células individuales. y secuenciado con lecturas finales emparejadas en una plataforma de secuenciación de próxima generación, 30.000 lecturas/celda. Las l...

El protocolo combina la tecnología de organoides intestinales humanos con el análisis transcriptómico de células individuales para proporcionar información significativa sobre la biología intestinal previamente inexplorada.

Single cell transcriptomics has revolutionized our understanding of the cell biology of the human body. State-of-the-art human small intestinal organoid ...

using-human-intestinal-organoids-to-understand-small-intestine

Research

JoVE Journal

Biology

Using Human Intestinal Organoids to Understand the Small Intestine Epithelium at the Single Cell Transcriptional Level

406 vistas.  Baylor College of Medicine. Estamos integrando la transcriptómica de una sola célula y la tecnología de organoides para comprender mejor la biología del intestino delgado. Estas tecnologías nos permiten una visión más profunda de la heterogeneidad celular que existe dentro de ese tejido. Las herramientas que mejoran el rendimiento, la sensibilidad y las resoluciones son las claves que hacen avanzar la investigación en este campo.Algunos ejemplos son la mejora de los méto...

Video: Autor destacado: Integración de la transcriptómica unicelular con cultivos de organoides para una investigación avanzada y conocimientos terapéuticos

Single cell transcriptomics has revolutionized our understanding of the cell biology of the human body. State-of-the-art human small intestinal organoid cultures provide ex vivo model systems that bridge the gap between animal models and clinical studies. The application of single cell transcriptomics to human intestinal organoid (HIO) models is revealing previously unrecognized cell biology, biochemistry, and physiology of the GI tract. The advanced single cell transcriptomics platforms use microfluidic partitioning and barcoding to generate cDNA libraries. These barcoded cDNAs can be easily sequenced by next generation sequencing platforms and used by various visualization tools to generate maps. Here, we describe methods to culture and differentiate human small intestinal HIOs in different formats and procedures for isolating viable cells from these formats that are suitable for use in single-cell transcriptional profiling platforms. These protocols and procedures facilitate the use of small intestinal HIOs to obtain an increased understanding of the cellular response of human intestinal epithelium at the transcriptional level in the context of a variety of different environments.

The protocol combines human intestinal organoid technology with single cell transcriptomic analysis to provide significant insight into previously unexplored intestinal biology.

Investigación

Biología

Preparation of Single Cell Suspensions from Differentiated 3D Human Intestinal Organoids for Single Cell Transcriptomics

To begin, thaw the enzymatic cell digestion reagent at 37 degrees Celsius for 30 minutes. Under a brightfield microscope at 10x magnification, observe the differentiated three-dimensional human intestinal organoids to ensure cell health. Replace the media from the wells of a 24-well plate containing differentiated organoids with 500 microliters of cold cell recovery solution.Pipette up and down to release the cells from the basement membrane. Transfer the cell suspension to a 1.5-milliliter microcentrifuge tube. Incubate the tube on ice for 10 minutes, pipetting up and and down every five minutes.Centrifuge the cell suspension at 400 g for three minutes at four degrees Celsius. Remove the supernatant from the tube without disturbing the pellet. Resuspend the pellet in 500 microliters of prewarmed enzymatic cell digestion reagent, pipetting up and down 10 times.Place the organoids for 30 minutes at 37 degrees Celsius in a carbon dioxide incubator. Every 10 minutes, pipette the entire volume 10 times using a P1000 pipette to help dissociate the cells. Centrifuge the cell suspension at 400 g for three minutes at four degrees Celsius, and resuspend the pellet in one milliliter of differentiation media.Rapidly pipette the cells up and down 50 times on ice to dissociate organoids into single cells. Filter the entire volume through a 70 micron tip strainer and collect the eluate in a fresh 1.5-milliliter tube. Then filter the eluate obtained through a 70 micron strainer on a 40 micron tip strainer.Add five microliters of 0.4%Trypan Blue to five microliters of cell suspension, and count viable single cells using Trypan Blue Exclusion. Dilute the sample with cell culture media to obtain 1000 cells per microliter. A total of 4, 402 single cells were isolated from differentiated ileal three-dimensional human intestinal organoids, representing expected cell types, including absorptive enterocytes and secretory cells.

Preparación de suspensiones unicelulares a partir de organoides intestinales humanos diferenciados en 3D para transcriptómica unicelular

Preparation of Single Cell Suspensions from Human Intestinal Organoids Differentiated on Membrane Cell Culture Insert

To begin, place the 15 milliliter tube containing prewarmed enzymatic cell digestion reagent in a 37 degree Celsius incubator until use. Aliquot 500 microliters of freshly prepared PBS/EDTA into the wells of a 24 well plate. Under a brightfield microscope, observe the growth of differentiated three dimensional human intestinal organoids and transwells.Transfer the cell culture inserts from the growth media to the PBS/EDTA solution. Remove the culture media from the apical side and replace it with 100 microliters of PBS/EDTA without disturbing the cell layer. After discarding PBS/EDTA, remove the insert from the well, blot it gently onto the edge of a paper towel and inverted on the bench top.Using a sharp scalpel blade, cut around the inner circumference of the membrane to remove the membrane from the insert. Transfer the membrane with forceps to the 1.5 milliliter tube containing 200 microliters of prewarmed enzymatic cell digestion reagent. Place the membrane for 30 minutes at 37 degrees Celsius in a carbon dioxide incubator.Every 10 minutes, pipette the entire volume five times using a P 200 pipette. Transfer, one to two microliters of cell suspension to a glass slide every 10 minutes to assess dissociation by qualitatively assessing the percentage of single cells. After dissociation, combine three replicate wells per condition in a single 1.5 milliliter micro centrifuge tube.Add 400 microliters of cell culture differentiation medium containing 10 micromolar ROCK inhibitor and mix gently by pipetting. Filter the entire volume through a 70 micron tip strainer, collecting the flowthrough in a fresh 1.5 milliliter tube. Then filter the flowthrough obtained through a 70 micron strainer on a 40 micron tip strainer.Add five microliters of 0.4%trypan blue to five microliters of cell suspension and count viable single cells. Dilute the sample with WRNE growth medium to obtain 1, 000 cells per microliter. A total of 5, 623 single cells were isolated from differentiated jejunal human intestinal organoids grown on membrane cell culture inserts.

Preparación de suspensiones unicelulares a partir de organoides intestinales humanos diferenciados en un inserto de cultivo celular de membrana

Preparation of Single Cell Suspensions from Human Intestinal Organoids Differentiated as 96 Well Monolayers

To begin, prepare enzymatic cell digestion reagent and PBS/EDTA for human intestinal organoids digestion. Under a brightfield microscope, confirm the growth of differentiated three-dimensional human intestinal organoids as monolayers. Discard the cell culture media from monolayer culture and replace it with 100 microliters of PBS/EDTA.After removing PBS/EDTA, add 100 microliters of warm enzymatic cell digestion reagent to each well. Place the plate at 37 degrees Celsius in 5%carbon dioxide incubator and pipette the entire volume five times every 10 minutes for 20 to 30 minutes. Transfer one to two microliters of cell suspension to a glass slide every 10 minutes to assess dissociation by observing the percentage of single cells.After dissociation, combine three replicate wells per condition in a single 1.5 milliliter microcentrifuge tube. Add 700 microliters of cell culture differentiation medium containing 10 micromolar ROCK inhibitor, and mixed gently by pipetting. Filter the entire volume through a 70 micron tip strainer, collecting the flow-through in a fresh 1.5 milliliter tube.Filter the flow-through obtained through a 70 micron strainer on a 40 micron tip strainer. Add five microliters of 0.4%Trypan Blue to five microliters of cell suspension, and count viable single cells. Dilute the sample with cell culture media containing ROCK inhibitor to obtain 1, 000 cells per microliter.A total of 9, 952 single cells were isolated from differentiated intestinal human intestinal organoids grown in 96 well plates.