Para comenzar, coloque el tubo de 15 mililitros que contiene el reactivo de digestión de células enzimáticas precalentado en una incubadora a 37 grados centígrados hasta su uso. Alícuota 500 microlitros de PBS/EDTA recién preparado en los pocillos de una placa de 24 pocillos. Bajo un microscopio de campo claro, observe el crecimiento de organoides intestinales humanos tridimensionales diferenciados y transpocillos.
Transfiera los insertos de cultivo celular del medio de crecimiento a la solución PBS/EDTA. Retire el medio de cultivo del lado apical y reemplácelo con 100 microlitros de PBS/EDTA sin alterar la capa celular. Después de desechar el PBS/EDTA, retire el inserto del pozo, séquelo suavemente en el borde de una toalla de papel e invertido en la mesa de trabajo.
Con una hoja de bisturí afilada, corte alrededor de la circunferencia interior de la membrana para quitar la membrana del inserto. Transfiera la membrana con pinzas al tubo de 1,5 mililitros que contiene 200 microlitros de reactivo de digestión de células enzimáticas precalentado. Coloque la membrana durante 30 minutos a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono.
Cada 10 minutos, pipetee todo el volumen cinco veces con una pipeta P 200. Transfiera de uno a dos microlitros de suspensión celular a un portaobjetos de vidrio cada 10 minutos para evaluar la disociación mediante la evaluación cualitativa del porcentaje de células individuales. Después de la disociación, combine tres pocillos replicados por condición en un solo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Añadir 400 microlitros de medio de diferenciación de cultivo celular que contenga 10 micromolares inhibidor de ROCK y mezclar suavemente mediante pipeteo. Filtre todo el volumen a través de un colador de punta de 70 micras, recogiendo el flujo en un tubo nuevo de 1,5 mililitros. Luego filtre el flujo obtenido a través de un colador de 70 micras en un colador de punta de 40 micras.
Agregue cinco microlitros de azul de tripano al 0,4% a cinco microlitros de suspensión celular y cuente las células individuales viables. Diluir la muestra con medio de crecimiento WRNE para obtener 1.000 células por microlitro. Se aislaron un total de 5.623 células individuales de organoides intestinales humanos yeyunales diferenciados cultivados en insertos de cultivo de células de membrana.
