Método de gradiente continuo para la purificación de islotes porcinos

Para comenzar, configure una bomba a un caudal de 200 mililitros por minuto y cargue 125 mililitros de solución de gradiente de alta densidad en el formador de gradiente continuo y, a continuación, en el procesador de celdas. Inicie la función de centrífuga del procesador de celda a 1, 000 RPM. Libere el aire del sistema y repórtelo con una solución de gradiente de alta densidad.

A continuación, añada 125 mililitros de solución de gradiente de alta densidad y 130 mililitros de solución de baja densidad al formador de gradiente. Cargue 100 mililitros de suspensión de tejido digerido. Aumente la velocidad del procesador de celdas a 2.000 RPM durante tres minutos.

Para preparar 16 tubos cónicos de 50 mililitros para recoger la fracción de islotes purificada, agregue 25 mililitros de medio RPMI a cada tubo y dispóngalos en orden ascendente. Recoja las fracciones de los islotes purificadas en los tubos cónicos preparados. Para teñir los islotes, recoja de 100 a 200 alícuotas de microlitros de cada fracción de islote purificada y evalúe el contenido de los islotes mediante tinción DTZ en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos.

Inspeccione cada fracción usando microscopía óptica a 4X, donde los islotes aparecerán de rojo oscuro a negro. Con este protocolo, se realizó el aislamiento de los islotes pancreáticos en tres cerdos. Las imágenes de campo claro mostraron islotes pancreáticos purificados, cuya viabilidad se caracterizó mediante tinción viva/muerta.

La distribución representativa del tamaño de los islotes después del aislamiento de los islotes mostró una distribución de tamaño de alrededor de 50 a 100 micras. Además, el rendimiento y la pureza se evaluaron utilizando un contador de células de islotes, lo que indica aislamientos pancreáticos porcinos eficientes.