Este método se puede utilizar para la disección de páncreas porcino que contiene conexión, lóbulos duodenales y esplénicos y eventual descelularización a través de la perfusión de detergentes a temperaturas frías. Aunque este método de descelularización proporciona una visión del páncreas porcino, también se puede aplicar a pancreata de otros animales grandes. La principal ventaja de esta técnica es que facilita la recuperación intacta de un órgano complicado, como el páncreas, para otras aplicaciones de ingeniería de tejidos.
Generalmente, los individuos nuevos en este método, lucharán porque la disección del páncreas intacto mientras que la identificación y ligar todos los vasos sanguíneos circundantes requiere mucha práctica para dominar. Antes de comenzar el procedimiento, utilice un tubo de silicona de tres por cinco milímetros para conectar el contenedor de detergente a la bomba peristáltica y un segundo tubo de silicona de tres por cinco milímetros para conectar la bomba peristáltica a la cámara de órganos a través del desgasificador. Conecte un Luer macho al extremo libre del segundo tubo y utilice un tercer tubo de silicona de tres por cinco milímetros para conectar la cámara de órganos al contenedor de recogida de detergente a través de la bomba peristáltica.
Por último, conecte una pipeta sin etiquetar de dos milímetros a los extremos libres de los tubos del contenedor de detergente y del contenedor de recogida de detergente. A continuación, coloque la configuración de descelularización en cuatro grados Centígrados. Para cosechar el páncreas, coloque un cerdo hembra heparinizado de 45 kilogramos sobre una mesa de disección en la posición supina, y use un bisturí para hacer una incisión de línea media de 40 centímetros desde el proceso de xifoide hasta el hueso púbico para exponer los órganos abdominales.
Después de identificar los lóbulos esplénicos, duodenales y de conexión, localice la papila duodenal principal y use dos suturas individuales para ligar oralmente el duodeno del sitio. Ligar el esófago inferior con suturas adicionales, y cortar entre las ligaduras con tijeras para facilitar la extracción del estómago. Separe los tejidos conectivos del colon para llegar al intestino delgado, y separe el tejido conectivo del colon que se une al lóbulo esplénico del páncreas.
El intestino delgado se une al páncreas por tejido conectivo en el lóbulo esplénico, pero también rodea el páncreas. Usted tiene que seguir cuidadosamente el camino intestinal para desenredar y separar el tejido conectivo entre el intestino y el páncreas. Después de ligar las arterias, extrae el colon del intestino delgado.
Identifique la vena mesentérica inferior, el árbol inferior de la arteria mesentérica, y ligar los vasos con una sutura caudal al páncreas y cortar con tijeras. Ligar la arteria esplénica y la vena juntas en el hilum, cerca del bazo, y cortar distalmente con tijeras para eliminar el bazo. Siga el duodeno hasta que los lóbulos duodenales y de conexión estén despejados, y ligar el duodeno al final con dos suturas separadas.
La parte del duodeno que está en estrecho contacto con la conexión y los lóbulos duodenales se extrae con el páncreas, ya que la ligadura de todos los pequeños vasos sanguíneos entre los dos órganos es demasiado difícil. Después de diseccionar la vena porta, ligar el vaso con una sutura para evitar cualquier fuga de sangre del hígado, y diseccionar y ligar el conducto biliar y la arteria hepática con dos suturas. Luego, corte la vena porta, la arteria hepática y el conducto biliar con tijeras.
Localice la aorta debajo de la vena renal y disecciona la aorta en la dirección craneal del músculo y el tejido conectivo hasta que el vaso llegue al páncreas. Ahora, voltea suavemente el páncreas.y disecciona la aorta.manteniendo intacta la arteria mesentérica superior y el tronco celíaco. Cortar el cranial de la aorta al tronco celíaco, y la contundente diseccionar el tejido circundante restante para permitir la cosecha del páncreas.
A continuación, utilice una jeringa de 50 mililitros conectada a una cánula de arteriotomía de cuatro milímetros para lavar el órgano a través de la aorta con la solución dos hasta que todo el órgano se perfunda o hasta que todo el órgano se enfríe. Coloque la solución dos páncreas perfundidos en una bandeja de metal sobre hielo, con aorta hacia arriba, y use tijeras para cortar las suturas del duodeno. Usa una pipeta de 25 mililitros para lavar el duodeno con 50 a 150 mililitros de agua ultrapura, y religate el tejido con suturas frescas.
Ligar un extremo de la aorta y todas las ramas, excluyendo la arteria mesentérica superior y el tronco celíaco, para evitar fugas, e insertar una cánula de arteriotomía de cuatro milímetros en el otro extremo de la aorta. A continuación, coloque el páncreas en la cámara de órganos y conecte la cánula del páncreas con un Luer macho. A continuación, perfunda el páncreas con la solución tres durante una hora a 20 mililitros por minuto, y congele el páncreas de doble perfugo a menos 20 grados centígrados en la solución cuatro hasta el inicio de la descelularización.
El día de la descelularización inicial, descongele el páncreas a cuatro grados centígrados y coloque el páncreas descongelado en la cámara de órganos descelularización. Conecte el tubo de entrada de detergente a la aorta del páncreas y lave el páncreas con la solución tres a 20 mililitros por minuto durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, decantar cualquier solución que quede en la cámara de órganos, y perfunda el páncreas durante 30 minutos a 20 mililitros por minuto en solución cinco a cuatro grados centígrados.
Al final de la solución cinco perfusión, perfunda el páncreas durante ocho horas a 20 mililitros por minuto en solución seis y cuatro grados Celsius, seguido de un lavado de 96 horas en solución fresca cinco a 20 mililitros por minuto y cuatro grados Celsius. Sustituya el lavado por 500 mililitros de DPBS complementados con calcio y magnesio durante 30 minutos a 37 grados celsius, seguido de perfusión con 250 mililitros de solución de siete durante cuatro horas a 20 mililitros por minuto y 37 grados Centígrados. A continuación, lave el órgano durante otras 120 horas con solución fresca de cinco a 20 mililitros por minuto y cuatro grados centígrados, y almacene el órgano en la solución ocho.
Aquí, se puede observar la morfología bruta de un páncreas normal, que aparece de color rosa claro y contiene lóbulos esplénicos, de conexión y duodenales. Después de la descelularización, el color rosa se pierde, y el páncreas procesado aparece de color blanco pálido. En un páncreas normal, muchos núcleos azules son evidentes por la tinción H y E, mientras que en un páncreas descelularizado los núcleos ya no se pueden visualizar, lo que confirma su pérdida.
El páncreas porcino intacto aislado, siguiendo este procedimiento, permitirá una perfusión completa y una descelularización exitosa preservando la estructura y permitiendo también obtener algunas proteínas de matriz extracelular. El páncreas decelularizado se puede utilizar para desarrollar estrategias de recelularización de órganos enteros en sistemas de biorreactor con tipos celulares relevantes. Después de la recelularización con células madre receptoras, el tejido diseñado páncreas se puede utilizar para aplicaciones clínicas y pruebas de drogas.
No olvide que trabajar con Triton X-100 y SDC puede ser extremadamente peligroso y que las precauciones, como usar guantes y preparar las soluciones bajo campana de humo, siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.
