Para comenzar, prepare una solución de recubrimiento que contenga matriz de membrana basal reducida con factor de crecimiento y medio de cultivo de organoides en una proporción de uno a dos. Agregue 115 microlitros de la solución de recubrimiento a cada pocillo de una placa de 48 pocillos y coloque la placa a 37 grados centígrados durante 30 minutos en una incubadora humidificada. Para el método del colágeno, agregue un mililitro de gel de colágeno a un inserto de membrana interna de 30 milímetros y déjelo solidificar durante 30 minutos a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada.
Para recolectar la mezcla celular, lave el tejido de melanoma recién resecado en una placa de Petri de 10 mililitros que contenga medio de lavado que se coloque sobre hielo. Con pinzas estériles, transfiera el tumor a un segundo plato con medio de lavado para el siguiente lavado con hielo. A lo largo de los tres ciclos de enjuague con tijeras estériles y una cuchilla, elimine el exceso de tejido conectivo, grasa y sangre residual.
Coloque el tumor en una placa de Petri vacía y píquelo finamente con cuchillas estériles. Luego transfiera el tejido picado a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 10 mililitros del medio de digestión preparado. Coloque el cónico en un baño de agua a 37 grados centígrados y en vórtice cada cinco minutos.
Después de 25 minutos, agregue 30 mililitros del medio ADMEM/F12 que contenga 10% de FBS para detener la digestión. A continuación, filtre la suspensión celular digerida a través de un colador de células de nailon de 70 micrómetros y enjuague el colador con ADMEM/F12 suplementado. Con una pipeta, recupere los medios restantes en la parte inferior del filtro.
A continuación, granule las células a 300 x g durante siete minutos a cuatro grados centígrados. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en el medio de cultivo de organoides. Para el cultivo, se sembraron 200.000 células en los pozos recubiertos de matrigel de antes de la guerra suplementados con 200 microlitros de medio de cultivo de organoides.
Alternativamente, siembre 1 millón de células mezcladas con un mililitro de gel de colágeno en el inserto de membrana de gel de colágeno presolidificado colocado en una placa de seis pocillos y agregue el medio de cultivo de organoides al pocillo. Para el paso de organoides de 150 a 200 micrómetros, transfiéralos a una cónica de 15 mililitros y lávelos con PBS de Dulbecco. Centrifugar la mezcla a 300 x g durante siete minutos a cuatro grados centígrados.
Después de eliminar el sobrenadante, incubar los organoides con sustituto de tripsina y mezclar cada tres minutos. Para detener la digestión, añadir ADMEM/F12 con medio sérico reducido que contenga un 10% de FBS. Centrifugar la mezcla a 300 x g durante siete minutos y resuspender el paladar en el medio de cultivo de organoides.
Finalmente, siembre la suspensión unicelular en un nuevo pocillo recubierto de colágeno o matrigel con la misma densidad de siembra inicial para la incubación. Las imágenes de microscopía de los organoides en matrigel tardío en el día dos y el día siete indicaron que el tamaño de los organoides aumentó gradualmente. Además, no hubo una diferencia estadísticamente significativa en la proporción de células T alfa-beta entre los tumores parentales y los organoides respectivos cultivados en matrigel o colágeno.
