Este protocolo describe un método de bajo costo para realizar ensayos de viabilidad de fármacos utilizando organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes. Las principales ventajas de esta técnica son el uso de materiales y equipos de laboratorio de bajo costo y fácilmente disponibles. Este método se puede utilizar antes de realizar costosas pruebas de detección de drogas de alto rendimiento.
Aunque el método se ocupa de realizar ensayos de viabilidad de fármacos en organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes, se puede aplicar a cualquier sistema de organoides, incluidos los de origen murino. Para comenzar, observe el extracto de membrana basal o los organoides que contienen BME bajo un microscopio de campo claro para garantizar una confluencia del 70 al 90%. Con una pipeta, agregue uno o dos mililitros de medio base precalentado al pocillo que contiene los organoides y disocie mecánicamente los organoides pipeteándolos hacia arriba y hacia abajo.
Transfiera toda la suspensión de organoides a un tubo cónico de 15 mililitros y haga un vórtice del tubo durante cinco a 10 segundos para desagregar aún más las células. A continuación, centrifugar las células a 1,107 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Con una pipeta monocanal, aspire y deseche el sobrenadante.
Vuelva a suspender el gránulo en un mililitro de reactivo de disociación organoide precalentado a 37 grados centígrados y transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Incubar la muestra durante siete minutos a 37 grados centígrados. A continuación, centrifugar el resultado en suspensión celular a 1,107 G durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo de la célula en un mililitro de medio base precalentado. Reconstituir las células en una mezcla de medios base y BME, manteniendo una concentración final de 20.000 células por cada 10 microlitros. Coloque una gota de tres microlitros de las células resuspendidas por pocillo de una placa negra opaca de 96 pocillos.
Incubar la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Finalmente, agregue 100 microlitros de medios organoides avanzados precalentados a cada pocillo antes de incubar la placa a 37 grados Celsius durante 24 a 72 horas. Realizar un tratamiento farmacológico de los organoides dos días después de sembrarlos.
Realizar un ensayo de viabilidad en los organoides siete días después del tratamiento farmacológico. Agregue 100 microlitros de reactivo de ensayo de viabilidad a cada pocillo, lo que eleva el volumen total a 200 microlitros, y agite la placa a 80 RPM durante cinco minutos. Luego deje que la placa se incube a temperatura ambiente durante 25 minutos más.
Mientras tanto, encienda el lector de placas de bioluminiscencia y abra el software de control ocular. Navegue para conectarse al instrumento" y seleccione Infinite 200Pro "Seleccionar luminiscencia" y script predeterminado "A continuación, en el menú desplegable, elija BD 96 FB Falcon BD Falcon 96 Flat Black" como tipo de placa para establecer los parámetros de luminiscencia. Asigne atenuación como ninguna.
Tiempo de integración como 1000 milisegundos y tiempo de estabilización como cero milisegundos. Finalmente, destape la placa, cárguela en el lector de placas y presione "iniciar" para comenzar. Se adquirieron imágenes de campo claro para los dos organoides diferentes derivados del paciente, o PDO, utilizados en el protocolo.
PDO uno, derivado de una biopsia tumoral y PDO dos derivado de ascitis. Los resultados del ensayo de viabilidad revelaron el porcentaje de células vivas en PDO uno y PDO dos después de que ambos fueron tratados con diferentes concentraciones de carboplatino. La tasa de crecimiento calculada, o valores de GR, se graficaron con respecto a las concentraciones de carboplatino correspondientes, y las métricas de GR revelaron que el valor de GR50 para la DOP uno era mucho más alto que el de la DOP dos.
Esto indicó que la PDO uno era más resistente a la quimioterapia con platino Durante la siembra, es crucial que la gota de tres microlitros de la suspensión celular se coloque directamente en el centro del pocillo. Si la gota se coloca demasiado cerca del borde del pocillo, puede hacer que la gota colapse, lo que afecta los resultados del ensayo.
