El PDX ha revolucionado los estudios preclínicos experimentales del cáncer. Ahora podemos imitar, en el laboratorio, lo que está sucediendo en los pacientes. Y ahora podemos trabajar en cómo superar la resistencia y cómo, a largo plazo, podemos aumentar la supervivencia de los pacientes.
Demostrar el procedimiento será Min Xiao. Para comenzar, transfiera el tejido de melanoma previamente recogido a una placa estéril de Petri. Trabajando con tijeras quirúrgicas, cuchilla de bisturí y fórceps, primero retire el tejido normal del tejido normal tanto como sea posible.
Y luego extirpar el tejido necrótico identificado por el tejido blanco pálido ubicado en el centro dentro del tumor. Luego usa un bisturí para subdividir un trozo de tumor inicial en trozos aproximadamente iguales para la implantación quirúrgica del ratón. Si el tejido tumoral es demasiado difícil para la disociación mecánica, usa un bisturí para picar los trozos del tumor lo más finamente posible para formar una suspensión.
Transfiera la suspensión a un tubo de 50 mililitros con la solución fría de sal equilibrada de Hank sin iones de calcio y magnesio. Centrifugar a 220 veces g durante cuatro minutos a cuatro grados centígrados. Después de extraer el sobrenadante, vuelva a suspender la suspensión en 10 mililitros de medios de digestión frescos y calientes por un gramo de tejido tumoral.
Coloque el tubo en un baño de agua de 37 grados Centígrados durante 20 minutos y mezcle vigorosamente cada cinco minutos con una pipeta desechable. Lave los purines con hasta 50 mililitros de HBSS, centrifugar a 220 veces g durante cuatro minutos a cuatro grados centígrados, y luego retire el sobrenadante. Agregue cinco mililitros de tampón TEG precalegado por un gramo de tejido tumoral, agite para volver a suspender suavemente y coloque el tubo a 37 grados centígrados durante dos minutos, sin mezclar.
Para apagar la tripina, agregue al menos un volumen igual de medios de tinción en frío y centrífuga a 220 veces g durante cuatro minutos a cuatro grados centígrados. Después de extraer el sobrenadante, añadir 10 mililitros de medios de tinción por un gramo de tejido tumoral, y volver a suspender el pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Filtrar a través de un colador celular de 40 micrómetros para obtener una suspensión de una sola célula para la inyección de ratón.
Para implantar la escisión quirúrgica o el tejido de la biopsia quirúrgica, primero afeite el cabello de la parte inferior de NSG seis a ocho semanas de edad anestesado ratones, dejando una superficie de aproximadamente 1,5 centímetros a tres centímetros sin pelo. Preparar trozos de tumor y dividir los lodos tumorales en un Petri en montículos individuales para la implantación quirúrgica. Usando una cuchilla de bisturí, haz una incisión de aproximadamente cinco milímetros de largo en el centro de la parte posterior del ratón.
Con un par de fórceps, la vida en la piel en el lado de la incisión frente al operador. Con tijeras en la otra mano, separar la piel de la capa muscular cortando suavemente la membrana fascial con pequeños cortes de tijera, creando así un bolsillo para el tejido tumoral. Usa una cuchilla de bisturí para recoger un mandril tumoral, así como un montículo individual de tejido de lodo tumoral, y coloca suavemente el tejido en el bolsillo creado.
A continuación, agregue 100 microlitros de matriz extracelular artificial en el montículo de tejido tumoral en el bolsillo. Usando dos pares de fórceps, tire hacia arriba de la incisión en ambos extremos para que los bordes de la herida se acerquen. A continuación, aplique uno o dos clips de la herida para cerrar la herida.
Inyecte por vía subcutánea de uno a cinco miligramos por kilogramo de analgésico. Cuando la curación sea completamente, después de aproximadamente siete días, retire los clips de la herida. Monitoree a los ratones una vez por semana para detectar tumores palpables.
Una vez que los tumores alcanzan el volumen deseado, utilice fórceps quirúrgicos para levantar la piel adyacente al tumor del ratón eutanizado y hacer un corte horizontal utilizando tijeras curvas. Utilice una técnica de separación contundente para movilizar la piel a ambos lados del tumor y sobre el tumor, exponiendo el tumor. Usa tijeras y una cuchilla de bisturí para separar el tumor de la fascia.
Corta el tumor y transfiételo a un plato estéril de Petri. Corta el tumor en trozos pequeños y elimina el tejido necrótico del tumor. Para depositar el tejido tumoral para su futura implantación, tome de dos a tres trozos pequeños de tumor y tímpelos en trozos de menos de uno por uno milímetro.
Transfiera todo el tejido picado a una vilia criogénica de dos mililitros. Agregue un mililitro de medios de congelación y mezcle bien. Coloque los viales en un recipiente de congelación celular preenfriado a base de isopropanol en hielo seco, almacene el recipiente en un congelador de menos 80 grados centígrados durante la noche y, a continuación, transfiera los viales al almacenamiento de nitrógeno líquido.
Para ajustar el tejido congelado para ensayos posteriores, coloque las piezas del tejido tumoral en un vial criogénico, coloque la ville criogénica en nitrógeno líquido inmediatamente y almacene los viales en un congelador de menos 80 grados centígrados. Cuando se compararon tres métodos diferentes de crecimiento del tejido tumoral, la suspensión de células madre de células tumorales con el uso de la digestión enzimática fue más exitosa. Además de permitir un crecimiento tumoral más rápido, también fue suficiente que un tumor inicial se expandiera en 10 a 20 ratones, mientras que el método de mandril tumoral y lodo sólo se puede ampliar en cinco a 10 ratones.
Los modelos de xenoinjerto derivados del paciente del melanoma a menudo reflejan la sensibilidad del fármaco que el paciente mostró cuando está en tratamiento. Un xenoinjerto derivado del paciente con melanoma que inicialmente respondió a un inhibidor de BRAF, pero en última instancia recayó, también mostró sensibilidad inicial a la inhibición de la proteína BRAF, además del inhibidor de la quinasa MEK, pero los tumores finalmente recayó. Es fundamental tener cuidado al preparar el tejido PDX para la banca, ya que esto asegurará el éxito en futuras expansiones de PDX, ensayos de terapia, así como la caracterización.
Con el material PDX, la secuenciación de ARN de una sola célula, la secuenciación completa de exomas y la caracterización proteómica, son algunos de los muchos métodos que nuestro laboratorio aprovecha para diseccionar la resistencia a la terapia. La técnica PDX permite a los investigadores investigar la resistencia a la terapia utilizando células tumorales que recapitulan mejor la biología tumoral en un paciente humano en relación con los modelos de cáncer tradicionales cultivados en plástico. Esta ventaja permite obtener más información predictiva.
Los investigadores siempre deben tener cuidado y utilizar el nivel de bioseguridad dos precauciones al manipular el tejido tumoral derivado de un paciente humano.
