Limitación de la dilución para la obtención de parásitos clonales transgénicos Plasmodium para combatir la resistencia a los medicamentos en la malaria

Para comenzar, verifique la secuencia de los genes deseados aislados de los parásitos Plasmodium falciparum tratados con medicamentos. Después de diluir los glóbulos rojos parasitados, añadir un volumen adecuado para conseguir un total de 50 parásitos en 10 mililitros de medio, asegurando un 2% de hematocrito. Luego, agregue 100 microlitros de este medio que contiene 50 parásitos a cada pocillo de la placa de 96 pocillos.

Coloque la placa en un secador hermético lavado con gas mezclado. E incubar a 37 grados centígrados, reponiendo el medio cada dos días. Reemplace el medio con RPMI completo que contenga 2% de hematocrito cada siete días hasta que aparezcan los parásitos.

Incline la placa de 96 pocillos en un ángulo de 45 grados para que los glóbulos rojos se asienten. Retire con cuidado el medio de cada pocillo con una pipeta multicanal. Observe un cambio de color a amarillo o rojo oscuro en los pocillos que contienen parásitos, que contrasta con el color rosado de los medios en los pocillos libres de parásitos.

A continuación, saque una pequeña cantidad de cultivo del pozo que exhibe el cambio de color y prepare un frotis en un portaobjetos etiquetado. Después de realizar la tinción de Giemsa, observe el portaobjetos bajo un microscopio. Transfiera el contenido del pozo donde se observaron los parásitos a un matraz T25 e incube para que los parásitos crezcan durante cuatro o cinco días.

Una vez que la parasitemia alcanza de dos a 3% de saponina, lisar 500 microlitros de cultivo de parásitos. Y extraer el material genético del parásito.