Para comenzar, incuba la solución de triglicina a 60 grados centígrados. Retire tres tubos de tiras de pellets de RPA del congelador. Golpee suavemente los tubos de tira contra la mesa de laboratorio para desalojar los gránulos blancos.
Transfiera los tres gránulos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros A.Pipetee 25 microlitros de agua sin nucleasas para enjuagar cualquier polvo de RPA restante en los tubos de tira. Transfiera la solución de enjuague a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros B. Luego, agregue 10 microlitros de la solución de triglicina 0,57 molar y 10 microlitros de mezcla de cebador al tubo de mezcla maestra B. Después de vórtice y girar por el tubo, colóquelo en hielo. A continuación, agregue 28,4 microlitros del tampón de RPA cinco veces al tubo de mezcla maestro B.Mezcle bien dando golpecitos fuertes o agitando varias veces.
Transfiera los gránulos recolectados en el tubo A al tubo de mezcla maestra B e invierta el tubo o golpee el fondo del tubo con el dedo varias veces para mezclar. Observe si la solución parece homogénea y monofásica. Coloque el tubo sobre hielo.
A continuación, añada 0,71 microlitros de transcriptasa inversa y 2,84 microlitros de RNasa H al tubo de mezcla maestro. Golpee suavemente o invierta el tubo de mezcla maestro hacia arriba y hacia abajo muchas veces. Gire brevemente el tubo antes de colocarlo en hielo.
Ahora, alícuota 8,4 microlitros de la solución de mezcla maestra a 10 tubos preenfriados de 1,5 mililitros y coloque los tubos en hielo. Después de alicuotas, coloque los tubos en una rejilla de metal sumergida en nitrógeno líquido para prepararlos para la liofilización. En el liofilizador, verifique las temperaturas del colector y del estante.
Ahora, cubra los tubos abiertos en la rejilla de metal con una hoja de papel blanco de limpieza. Coloque la rejilla de metal junto con los tubos abiertos en el estante del liofilizador y cierre la puerta del estante. A continuación, seleccione el programa deseado y pulse Iniciar.
Después de 30 minutos del paso de secado secundario, presione detener. Libere la presión abriendo la válvula de liberación de vacío. Después de retirar la rejilla del estante, tape los tubos inmediatamente.
