El protocolo de gelificación produce reacciones de qPCR listas para usar que disminuyen el tiempo y los pasos necesarios para iniciar una carrera. Este protocolo permite que las reacciones de qPCR se produzcan y controlen para determinar la calidad y grandes cantidades a la vez, disminuyendo las posibilidades de error del operador durante los cálculos de recetas o la alícuota en pozos. Este método se puede aplicar a cualquier qPCR que ya esté totalmente optimizada en el formato congelado convencional.
La demostración visual de este método es importante porque dos de los principales pasos de control de calidad son visuales. Para preparar la solución de melezitosa, pese cuatro gramos de melezitosa en un tubo de plástico de 15 mililitros, agregue seis mililitros de agua libre de nucleasa y vórtice a velocidad máxima hasta que el polvo esté solubilizado. Haga el volumen final a 10 mililitros con agua libre de nucleasa, luego etiquete y almacene la solución a dos a ocho grados centígrados durante un máximo de seis meses.
Para preparar la solución de trehalosa, pese cuatro gramos de trehalosa en un tubo de plástico de 15 mililitros, agregue seis mililitros de agua libre de nucleasa y vórtice a la velocidad máxima hasta que el polvo esté solubilizado. Luego enrasar el volumen a 10 mililitros con agua libre de nucleasas y filtrar la solución a través de un filtro de 0,2 micras. Etiquete y guarde la solución a dos a ocho grados centígrados durante un máximo de seis meses.
Para preparar la solución de glucógeno, pese dos gramos de glucógeno en un tubo de 15 mililitros, agregue seis mililitros de agua libre de nucleasa y vórtice hasta que el polvo esté solubilizado. Mantenga la solución a dos a ocho grados centígrados durante ocho a 12 horas porque la solubilización del glucógeno produce muchas burbujas. Al día siguiente, retirando la solución de la incubación, enrasar el volumen a 10 mililitros con agua libre de nucleasas y almacenar la solución etiquetada a dos a ocho grados centígrados durante un máximo de seis meses.
Para preparar la solución de lisina, pese 7.5 miligramos de lisina en un tubo de 15 mililitros, agregue seis mililitros de agua libre de nucleasa y vórtice hasta que el polvo esté solubilizado. Enrasar el volumen a 10 mililitros con agua libre de nucleasas. Filtre la solución a través de un filtro de 0,2 micras y guárdela a dos a ocho grados centígrados durante un máximo de seis meses.
Para preparar la mezcla de gelificación, mezcle los volúmenes apropiados de soluciones madre en un tubo de plástico de 50 mililitros. Mezcle los reactivos invirtiendo el tubo 10 veces y guarde la solución etiquetada a dos a ocho grados centígrados durante un máximo de tres meses. Para preparar la mezcla maestra de qPCR para la gelificación, descongele los reactivos en un recipiente refrigerado.
Luego mezcle los volúmenes apropiados de los reactivos en un tubo de 1.5 mililitros para preparar suficiente mezcla maestra para una tira de ocho tubos o una placa de 96 pocillos. A continuación, pipetear 18,5 microlitros de la mezcla maestra de gelificación en cada pocillo de reacción y colocar los tubos o la placa en el soporte conductor del calor dentro del horno de vacío. Si usa 96 placas de pozo, coloque una bolsa de arcilla de bentonita en el horno por cada dos placas de 96 pocillos para la absorción de agua.
Cuando se complete el ciclo, verifique la gelificación adecuada de los reactivos en los tubos o placas asegurándose de que el volumen se reduzca visiblemente a unos cinco microlitros y que los líquidos no se muevan al golpear los tubos o placas con los dedos. Selle y guarde los tubos o placas a dos a ocho grados centígrados durante ocho a 12 horas antes de usarlos. Para usar la qPCR gelificada, retire la tira de tubo o la placa del refrigerador y ábrala en una estación de trabajo para la manipulación de muestras.
Agregue 15 microlitros de agua libre de nucleasa y cinco microlitros de muestra de ADN a cada recipiente de reacción. Selle los tubos o placas, ejecute el experimento deseado y realice análisis de datos regulares. En el protocolo actual, la temperatura dentro de la cámara se mantiene constante a 30 grados centígrados, mientras que la presión varía entre 910 y 930 milibares y cerca del vacío.
Después del ciclo de vacío, la mezcla maestra dentro del tubo disminuye de volumen, se gelifica en la parte inferior y no salpica las paredes cuando se golpean los tubos. Si la gelificación es incompleta, el líquido salpica las paredes del tubo cuando se golpean los tubos. La detección de ADN de Trypanosoma cruzi utilizando secuencias de oligonucleótidos publicadas se muestra aquí.
La detección de la misma muestra cuando la gelificación no se ejecutó correctamente, resultó en una pérdida de sensibilidad. El paso más crítico es el cálculo del volumen de reactivos antes de la gelificación. El operador debe recordar no agregar agua, ya que se eliminará durante el proceso.
Si se siguen de cerca los pasos del protocolo, los operadores con conocimientos básicos de laboratorio y biología molecular no tendrán dificultades para realizar el proceso de gelificación.
