Para empezar, prepare las nanopartículas de ARN bicatenario de quitosano para alimentar a las larvas de gusano de seda. A continuación, elija larvas de gusano de seda del quinto estadio recién mudadas de tamaño similar para el experimento de alimentación. Coloque cada larva individualmente en un pocillo de un plato de seis pocillos.
Cubra el plato y deje morir de hambre a las larvas durante 24 horas. A continuación, enjuague las hojas de morera frescas con agua desionizada y séquelas con papel de cocina limpio. Corta las hojas completamente secas en discos de hojas de un centímetro por un centímetro.
Disuelva las nanopartículas de quitosano dsRNA en agua libre de nucleasas a una concentración de 500 nanogramos por microlitro antes de su uso. Cubra 10 microlitros de nanopartículas de dsRNA de quitosano, nanopartículas de quitosano de control y dsRNA desnudo por separado en la superficie de cada disco de hoja de morera. Deje que las soluciones se sequen al aire en los discos de las hojas a temperatura ambiente durante cinco minutos.
A continuación, ofrezca un disco de hoja recubierto de nanopartículas o de dsRNA a cada larva todos los días. Una vez que las larvas consumen completamente el disco de la hoja recubierta, cada día, proporcione hojas frescas de morera. Al sexto día, coloque las larvas en hielo hasta que estén inmóviles.
Para diseccionar las larvas, corte el tórax con unas tijeras en una placa de Petri limpia y use pinzas para sacar el intestino medio. Después de eliminar el contenido. lavar el intestino medio en una placa de Petri con agua sin nucleasas.
Congele el intestino medio a menos 70 grados centígrados en un tubo de 1,5 mililitros. La alimentación con nanopartículas de quitosano dsRNA en gusanos de seda resultó en una reducción del 79% en los niveles de transcripción de BmToll9-2 en comparación con los tratamientos de control. Las larvas de gusano de seda tratadas con nanopartículas de quitosano dsRNA silenciador BmToll9-2 fueron visiblemente más pequeñas que las larvas de control.
Los capullos de las larvas silenciadas de BmToll9-2 también fueron significativamente más pequeños que los del grupo de control.
