Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la epigenética, como la cantidad de modificaciones cromáticas reguladas de una manera específica de tipo celular junto con los genomas. La principal ventaja de esta técnica es que podemos aislar la cromatina de las células objetivo y luego seguir la corriente típica gitana aguas abajo. Así que este método puede proporcionar información sobre el trimincil específico de la neurona, lysinc 4, opisoncilly.
También se puede aplicar a otras modificaciones de histonas, otros tipos de células y, a continuación, otros organismos modelo. Demostrando el procedimiento estará Mari Mito, una técnico de mi laboratorio. Para empezar, utilice tijeras de resorte fino para diseccionar el tejido de interés en trozos pequeños.
Agregue los fragmentos de tejido a un recipiente limpio lleno de nitrógeno líquido. Luego, transfiera los fragmentos de tejido a dos tubos mililitros llenos de nitrógeno líquido. Almacene los tubos a menos 80 grados centígrados durante cinco minutos con la tapa abierta para evaporar el nitrógeno líquido.
Coloque los tubos que contienen las muestras de tejido en un estante de hielo metálico refrigerado. A continuación, coloque una bala metálica en un tubo de 1,5 mililitros y enfríe con nitrógeno líquido. Coloque la bala de metal refrigerado en uno de los tubos de muestra.
Cierre la tapa y ajuste el tubo en el soporte del tubo de una amoladora criogénica. Inmediatamente, sumerja el soporte del tubo montado en nitrógeno líquido durante un minuto. Inserte el soporte del tubo congelado en el cassette exterior de la amoladora criogénica.
Y agítalo vigorosamente durante 30 segundos, 60 veces. Después de esto, desmontar la amoladora criogénica, quitar la bala de metal. Y coloque el tubo en un enfriador de muestra pre-refrigerado.
Almacene el refrigerador a 20 grados Celsius negativos durante 15 minutos. A continuación, agregue 900 microlitros de 1%formaldehído al tubo y pipeta para mezclar. Transfiera la suspensión a un nuevo tubo de dos mililitros con 900 microlitros de 1% de formaldehído.
A continuación, fijar la suspensión durante 10 minutos con rotación suave a 23 grados Celsius. Para detener la reacción de fijación, añada 100 microlitros de 2,5 molares de glicina al tubo. Y centrifugar a 3.000 veces la gravedad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Después de esto, desecha el súper sobrenadante. Agregue un mililitro de PBS al tubo y el vórtice para mezclar. Centrifugar a 3.000 veces la gravedad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Repita este paso de lavado, dos veces más. A continuación, agregue 500 microlitros de tampón de lysis uno al pellet y pipeta para mezclar. Centrifugar el tubo durante cinco minutos a 3.000 veces la gravedad a cuatro grados centígrados y deseche el sobrenadante.
Agregue un mililitro de tampón de lelisis dos al pellet y el vórtice para mezclar. Luego, centrifuga la suspensión durante cinco minutos a 3.000 veces la gravedad a cuatro grados centígrados y deseche el sobrenadante. Después de esto, añadir 800 microlitros de tampón de ensayo de inmunoprecipitación por radio con cóctel inhibidor de la proteasa al pellet y pipeta para mezclar.
Centrifugar la suspensión durante cinco minutos a 3.000 veces la gravedad a cuatro grados centígrados y deseche el sobrenadante. A continuación, añadir 500 microlitros de tampón RIPA con cóctel inhibidor de la proteasa al pellet. Luego, centrifuga la suspensión durante cinco minutos a 3.000 veces la gravedad a cuatro grados centígrados y deseche el sobrenadante.
Añadir un mililitro de tampón RIPA con cóctel inhibidor de la proteasa. Inmediatamente después de añadir el tampón RIPA con el cóctel inhibidor de la proteasa, transfiera el izado a un tubo sonicador. Y coloque el tubo en un ultrasonicador.
Usando los ajustes descritos en el protocolo de texto, corta la cromatina. A continuación, transfiera la muestra a un tubo de baja unión de 1,5 mililitros de proteína. Y centrifugarlo durante cinco minutos a 20.000 veces la gravedad a cuatro grados centígrados.
Recoger el sobrenadante de la muestra y transferirlo a un nuevo tubo de baja unión proteica. En este protocolo, se introdujo y demostró la secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina en tándem. Durante el procedimiento, la calidad del ADN se probó en varios pasos.
Inmediatamente después de la sonicación, el ADN cizallado fue aislado y probado con máquina de electroforesis microfluídica. Después de utilizar anticuerpos anti-FLAG y anti-H3K3me3 para realizar la purificación de afinidad, se volvió a comprobar la calidad del ADN. La especificidad de la purificación inmune del ADN en H2B-FLAG se confirmó con muestras de control negativo.
Donde se detectaron cantidades insignificantes de ADN. Más adelante en el protocolo, se verificó la calidad de la biblioteca de secuenciación. El éxito de ChIP y T-ChIP se evidenciaron mediante análisis de enriquecimiento utilizando imprimaciones dirigidas a la región promotora del gen GAPDH.
Se obtuvieron redistribuciones representativas a lo largo de tres genes de neuronas. Y se observó el enriquecimiento de lecturas en los cinco extremos principales de los genes por neurona T-ChIP buscar sobre todo el cerebro T-ChIP buscar. Después de un estabilismo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo epigenético exploren la modificación específica de la histona del tipo celular general ampliamente en las neuronas en ratones.
No olvide que trabajar con formaldehído puede ser extremadamente peligroso y tomar precauciones como usar ropa de goma y gafas siempre debe tomarse mientras se realiza este procedimiento.
