Para comenzar, coloque los tejidos de ratón extraídos en el tubo del molinillo de pañuelos que contiene 50% de solución salina helada y 50% de metanol. Inserte el mortero en el tubo del molinillo y gírelo suavemente cinco veces para homogeneizar el tejido. Transfiera inmediatamente el tejido homogeneizado a un tubo de 15 mililitros.
Añadir dos mililitros de metanol y un mililitro de hidroxilamina 0,1 molar a la muestra homogeneizada. Deje reposar la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para la extracción de retinoides, agregue 10 mililitros de hexano al homogeneizado y agite el tubo horizontalmente durante al menos 10 segundos.
Centrifugar la mezcla homogeneizada de hexano durante tres minutos a 1000 x g para separar las fases. Con una pipeta, transfiera la capa de hexano a un tubo de vidrio separado de 15 mililitros y coloque la muestra en una centrífuga de vacío para evaporar completamente el hexano de la muestra extraída. Vuelva a suspender los retinoides secos en el tubo de 15 mililitros con 100 microlitros de hexano y pozo de vórtice para asegurarse de que todos los retinoides se disuelvan.
Pipetee los 100 microlitros completos de hexano en el segundo tubo de vidrio y haga un vórtice del tubo para disolver los retinoides. A continuación, pipetee los 100 microlitros de hexano en un solo vidrio inerte para el análisis por HPLC. Configure la ejecución de HPLC utilizando las condiciones adecuadas.
Identifique los picos utilizando los tiempos de retención y los espectros UV para cada retinoide de interés en función de los estándares. Utilizando el sistema de datos cromatográficos, integre los picos identificados y haga referencia a la curva estándar externa para cuantificar el analito. En el caso de los cromatogramas biológicos de tejidos, integre manualmente los picos para tener en cuenta las variabilidades en los tiempos de retención.
En el cromatograma del ojo de ratón de control, se identificaron 13-cis-retinal, 11-cis-retinal, all-trans-retinal, 11-cis-retinol y all-trans-retinol. En el cromatograma del ojo de ratón tratado con hidroxilamina, se incrementaron los tiempos de retención. Los isómeros syn y anti de estos retinaldehídos también estaban presentes.
En el cromatograma del tejido hepático de ratón, se identificaron el palmitato de retinilo y el todo-trans-retinol como las principales formas de vitamina A, y el de la sangre de ratón mostró un pico de trans-retinol. Los espectros de absorción UV confirmaron la presencia de isoformas de retinoides en los picos del cromatograma.
