Esta investigación fue posible gracias a un premio de la Fundación Nacional de Ciencias de Carrera (MCB-0746066, Caracterización de los activadores transcripcionales que regulan el comportamiento emergente) de RDW Estamos muy agradecidos a LJ Shimkus, Goldman BS, Suen G., Singer M. Welch LG, Murphy KA, y HG Taylor útil para los debates y comentarios sobre el manuscrito.

Material necesario: <ul><li> Klett metros </li><li> Pipeta y puntas </li><li> 2,5 ml tubos de microcentrífuga </li><li> Microcentrífuga </li><li> CTTYE los medios de comunicación: <ul><li> 1,0% casitona (Difco Laboratories), el 0,5% de extracto de levadura (Difco Laboratories), </li><li> 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8,0 mM MgSO 4 </li></ul></li><li> TPM medios de comunicación: <ul><li> 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8,0 mM MgSO 4 </li></ul></li><li> Agarosa </li><li> Baño de agua a 55 ° C </li><li> Portaobjetos de vidrio </li><li> Cubreobjetos de vidrio de gran </li><li> 2 x 2 cm, 0,5 mm de espesor de caucho de silicona junta (Grace Bio-Lab Inc.) </li><li> Parafilm (o cinta de etiquetado) </li><li> Fórceps </li><li> Pequeños clips de encuadernación </li><li> Micro-pipeta de muestreo (Fisher) </li><li> 100 l punta de vidrio desechable (Fisher) </li><li> Kimwipes </li></ul> Parte 1: Preparación de la célula Comience por crear un ambiente estéril. <ul><li> Limpie espacio de trabajo, guantes de Don, y encender la hornilla. </li></ul><ol><li> Iniciar un cultivo de una noche de las células mediante la inoculación en un matraz que contenía caldo CTTYE y se incubaron en la oscuridad a 32 ° C con agitación vigorosa. </li><li> Una vez que el cultivo alcanzó una densidad de 5 x 10 8 células / ml, pipeta de 1 ml de células en un tubo de microcentrífuga de 2,5 ml. </li><li> Pellet células por centrifugación durante 2 min a 16.000 xg (o velocidad máxima). </li><li> Se decanta y se desecha el sobrenadante. </li><li> Lavar el sedimento celular con 1 ml TPM (sal balanceada en nutrientes, sin los medios de comunicación). <ul><li> una nueva suspensión y agitar </li></ul></li><li> Re-pellet células girando durante 2 min a 16.000 xg (o velocidad máxima). </li><li> Se decanta y se desecha el sobrenadante. Paso crítico </li><li> Completamente re-suspender el precipitado en 100 medios de comunicación TPM l utilizando una combinación de pipeteo y agitación. IMPORTANTE: Este paso asegura que no hay grupos de células en el tubo de la izquierda. Esto puede tomar un tiempo. </li><li> Establecer las células a un lado a temperatura ambiente mientras se prepara las placas de ensayo de seguimiento. </li></ol> Parte 2: Preparación de Agar <ol><li> Prepare 50 ml de ambos TPM (ensayo de los medios de comunicación) y CTTYE (disco nutritivo) los medios de comunicación. </li><li> Añadir 0,5 g de agarosa a cada uno (de agarosa es menor de difracción de agar). </li><li> Autoclave para esterilizar. </li><li> Después de la esterilización, mantener los medios de comunicación a 55 ° C en una incubadora (o baño de agua), mientras que la construcción de los complejos análisis de seguimiento de la placa. </li></ol> Parte 3: Construcción de disco nutritivo <ol><li> Coloque una junta de silicona estéril de goma de 0,5 mm de espesor en la parte superior de una llama-esterilizados portaobjetos de vidrio, formando un pequeño pozo. </li><li> Pipeta ~ 300 l de los 55 ° C CTTYE media / agarosa en el pozo creado por la junta en la diapositiva que contiene el disco y nutritivo. Los medios de comunicación CTTYE / agarosa debe montículo. </li><li> Coloque una diapositiva llama esterilizada (sin juntas) en la parte superior de los medios de comunicación CTTYE / agarosa. IMPORTANTE: Esta diapositiva se debe establecer en un ángulo para evitar que se formen burbujas. </li><li> Una vez que la tapa está en su lugar, la abrazadera del complejo, junto con clips de la carpeta mini - una a cada lado. </li><li> Lugar del complejo recortado a 4 ° C y permitir que los medios CTTYE / agarosa al conjunto. Esto generalmente toma alrededor de 5 min. </li></ol> Parte 4: Preparación de seguimiento del ensayo - Configurar Complejos Plate Ensamblar los componentes, preparar los complejos de diapositivas, coloque el disco nutritivo, vierta los medios de comunicación TPM / agarosa, complejos placa separada y seco, las células de la placa, y montamos el seguimiento de los complejos de ensayo de placa. Ensamblar los componentes de la placa de complejo <ol><li> Para cada complejo, llama esterilizados un portaobjetos de vidrio </li><li> Coloque una junta de autoclave en la parte superior de la diapositiva y dejar de lado (esterilizada hacia arriba). Esta será la parte inferior de la prueba. </li><li> Llama esterilizar una cubierta de vidrio antideslizante y colocarlo en la parte superior de una placa de vidrio segundo microscopio envueltos con cinta de etiquetado (o Parafilm) y dejar de lado (esterilizada hacia arriba). Esto se utiliza como una diapositiva de apoyo para mantener el cubreobjetos de las grietas. Esta será la parte superior de la prueba. </li><li> Llama esterilizar a un portaobjetos de vidrio microscopio tercero y dejar de lado (esterilizada hacia arriba). Esto será utilizado para aplanar la agarosa. IMPORTANTE: Asegúrese de que las juntas forman un sello con el vidrio presionando hacia abajo con las pinzas, de lo contrario los medios de comunicación / agarosa podría secarse. </li></ol> P<html> encaje disco nutritivo IMPORTANTE: Los pasos del 5 al 10 se debe hacer a lo complejo de diapositivas de una en una, de lo contrario los medios de comunicación / agarosa podría comenzar a solidificarse como resultado una calidad de cine pobre. <ol start="5"><li> Retire el disco de forma complejo nutritivo 4 ° C (paso 5 de la parte 3) y separarlas de las diapositivas de la exposición de ahora solidificado CTTYE / agarosa. </li><li> Eliminar un &#39;disco nutritivo &quot;1 mm de diámetro de los medios de comunicación CTTYE / agarosa y se ha descrito anteriormente con una pipeta de muestreo de micro-con una punta de vidrio de 100 l desechable y colóquela en el pozo creado por la junta en la hoja de la cubierta (paso 3) . </li></ol> En placas Paso crítico <ol start="7"><li> Pipeta ~ 300 l de los 55 ° C TPM media / agarosa en el pozo creado por la junta en la hoja de la cubierta y que contiene el disco nutritivo. Los medios de comunicación TPM / agarosa debe montículo. Paso crítico </li><li> Colocar la placa de la llama esterilizadas sin junta (del paso 3) en la parte superior de los medios de TPM / agarosa. IMPORTANTE: Esta diapositiva se debe establecer en un ángulo para evitar que se formen burbujas. </li><li> Una vez que el carro (desde el paso 5) está en su lugar, la abrazadera del complejo, junto con clips de la carpeta mini - una a cada lado. </li><li> Lugar del complejo recortado a 4 ° C y permitir que los medios / de agarosa al conjunto. Esto generalmente toma alrededor de 5 min. </li></ol> Platos separados y seco IMPORTANTE: Para evitar que los medios de comunicación / agarosa de la desecación, los pasos 11 a 20 sólo se debe realizar en un complejo de diapositivas a la vez. IMPORTANTE: Para obtener mejores resultados, los pasos 11 a 13 se realizaron a 4 ° C. <ol start="11"><li> Una vez que los medios de comunicación / agarosa, quite el clips de la carpeta y apretar al final del complejo para aflojar la diapositiva cinta envuelta. </li><li> Elimina la diapositiva cinta envuelta y el lugar en el banco para su uso posterior. Paso crítico </li><li> El uso de pinzas a modo de cuña, separar la hoja de la cubierta / recinto junta / media / agarosa de la diapositiva de apoyo (sin empaque) y descartar el apoyo de diapositivas. IMPORTANTE: No usar un movimiento de palanca para separar la hoja de la cubierta / recinto de la junta. Esto podría resultar en la ruptura cubreobjetos y / o la adherencia media / agarosa a la diapositiva de apoyo. </li><li> Coloque la hoja de la cubierta / recinto junta / media / agarosa en la diapositiva en cinta envuelta (lado junta hacia arriba) y eliminar de 4 ° C. Lugar este próximo complejos a un quemador para permitir que toda la humedad se evapore visible de la nueva exposición media / agarosa superficie - no más de 1 min. IMPORTANTE: No deje que la seca media / agarosa durante demasiado tiempo ya que esto podría afectar la M. xanthus enjambre comportamiento. </li></ol> Células de la placa Paso crítico <ol><li> Una vez que el exceso de humedad se haya evaporado, pipeta de 0,5 l de las células concentradas (el paso 8 de la parte 1) en los medios de comunicación / agarosa de aproximadamente 1 mm de distancia desde el disco de nutrientes. IMPORTANTE: Es muy importante asegurarse de que las células se depositan moviendo la pipeta hacia abajo y luego hacia arriba. Esto asegura que el enjambre será circular. IMPORTANTE: Es muy importante no tocar la punta de la pipeta para los medios de comunicación / agarosa. Esto hará que una depresión en la superficie y cambiar el comportamiento de la M. xanthus enjambre. CONSEJO: Presione el punta de la pipeta antes de acercarse a los medios de comunicación / agarosa. Esto permitirá una disminución de las células que aparecen en la parte inferior de la punta de la pipeta y que sea más fácil para depositar las células. </li><li> Una vez que las células se depositan, el lugar de la próxima complejo a un segundo plano para permitir que el lugar de células para secar - no más de 20 segundos. </li></ol> Ensamble ensayo <ol><li> Una vez que el lugar de células se ha secado, alinear el conjunto de diapositivas / junta (del paso 1) con la junta en la hoja de la cubierta / junta / media / agarosa / celular compleja (del paso 13) y presione suavemente para formar un sello. Paso crítico </li><li> Limpie las superficies de las diapositivas y hoja de cubierta con un Kimwipe para eliminar los residuos dejados por el Parafilm. El ensayo terminado debe ser similar a la Figura 1. </li><li> Coloque el complejo de diapositivas completa en la etapa de calefacción mantiene a 32 ° C (deslizarse, hoja de cubierta para arriba) inmediatamente después de limpiar (paso 15) para evitar que el la formación de condensación. Si se ha formado condensación, deje reposar de diapositivas complejas en el escenario calentado por varios segundos antes de iniciar el software de adquisición de imágenes. </li><li> Elegir el objetivo adecuado (2X, 4X o 10X). </li></ol> Parte 5: Preparación de la película t &quot;&gt; paso crítico <ol><li> Encienda la cámara y el microscopio, y comprobar los niveles de luz (asegúrese de que la luz no sea demasiado intensa). Arranca el ordenador y abrir el programa de adquisición de imágenes. </li><li> Haga clic en la ventana de la imagen en vivo y enfocar el microscopio. La imagen debe ser similar a la que se ve en la Figura 3. Aviso de la superficie del agar uniforme. </li><li> Comenzar a adquirir las imágenes. Paso crítico </li><li> Comprobar el enfoque con regularidad durante la primera hora, como los medios de comunicación / agar tiende a acumularse causando el foco a la deriva. </li><li> Limpie el área de trabajo. </li><li> Una vez que la adquisición de imágenes, transmite las imágenes adquiridas para el almacenamiento y romper el complejo de diapositivas por inmersión en etanol al 90% durante la noche. </li><li> Juntas de autoclave para su reutilización. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Ilustración de dibujos animados de la compleja placa TM. (A) muestra el complejo básico TM placa de despiece y sección transversal. (B) muestra el uso de grandes juntas. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Cluster microscopio. Cada nodo microscopio (recuadro) consiste en un microscopio Nikon E400, los objetivos, una etapa de calefacción, una cámara de Insight, y un ordenador portátil. Cada nodo está conectado en red entre sí y vinculados a un equipo controlador maestro. Dos de los nodos se configuran con las capacidades de fluorescencia que consisten en la fuente de luz y dos persianas EXFO Uniblitz. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Una imagen de 20X de los aparatos de ensayo de seguimiento en el tiempo = 0. Barra de escala, de 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Capacidad de adaptación del complejo de la placa de TM. (A) una imagen de 100X de M. xanthus deslizamiento en la motilidad CTTYE en 1,0% de agar. (B) una imagen de 20x de P. aeruginosa crispar la motilidad. (C) una imagen de 20X S. marcescens enjambre motilidad. Tanto (B) y (C) se analizaron en LB en 1,0% de agar. (D) una imagen de 40x de M. smegmatis deslizamiento en la motilidad de LB en el 0,5% de agar. Esta imagen fue tomada utilizando la configuración de ensayo alternativo se ve en la figura 1B. Video 1. Un video de lapso de tiempo de un enjambre sometido a la prueba de seguimiento. Video 2. Un video de lapso de tiempo de una M. xanthus enjambre donde el 1% de las células están marcados con fluorescencia. Alternando imágenes de contraste de fase y fluorescentes fueron capturados y superpuestos para dilucidar la posición de las células fluorescentes en el enjambre. Este video fue grabado en CTTYE en 1,0% de agar. Video 3. Un video de lapso de tiempo de M. xanthus deslizamiento motilidad. Este video fue grabado en CTTYE en 1,0% de agar. Video 4. Un video de lapso de tiempo de P. aeruginosa crispar la motilidad. Este video fue grabado en LB en el 1,0% de agar. Video 5. Un video de lapso de tiempo de S. marcescens enjambre motilidad. Este video fue grabado en LB en el 1,0% de agar. Video 6. Un video de lapso de tiempo de M. smegmatis deslizamiento motilidad. Este video fue grabado en LB en el 0,5% de agar con la configuración de ensayo alternativo se ve en la figura 1B.

<ol>
	<li>Taylor, R. G., Welch, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+as+an+emergent+property+of+a+swarm.">Chemotaxis as an emergent property of a swarm.</a> J Bacteriol. 190, 6811-6816 (2008).</li><li>Curtis, P. D., Taylor, R. G., Welch, R. D., Shimkets, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Organization+of+Myxococcus+xanthus+During+Fruiting+Body+Formation.">Spatial Organization of Myxococcus xanthus During Fruiting Body Formation.</a> J Bacteriol. 189, 9126-9130 (2007).</li><li>Mignot, T., Merlie, J. P., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+pole-to-pole+oscillations+of+a+bacterial+gliding+motility+protein.">Regulated pole-to-pole oscillations of a bacterial gliding motility protein.</a> Science. 310, 855-857 (2005).</li><li>Stoodley, P., Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachment+surface+migration,+and+other+dynamic+behavior+in+bacterial+biofilms+revealed+by+digital+time-lapse+imaging.">Detachment surface migration, and other dynamic behavior in bacterial biofilms revealed by digital time-lapse imaging.</a> Methods Enzymol. 337, 306-319 (2001).</li><li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+as+microbial+development.">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu Rev Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li><li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+and+twitching+motility+are+necessary+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development.">Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Mol Microbiol. 30, 295-304 (1998).</li><li>Dalton, H. M., Poulsen, L. K., Halasz, P., Angles, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substratum-induced+morphological+changes+in+a+marine+bacterium+and+their+relevance+to+biofilm+structure.">Substratum-induced morphological changes in a marine bacterium and their relevance to biofilm structure.</a> J Bacteriol. 176, 6900-6906 (1994).</li><li>Dworkin, M., Eide, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myxococcus+xanthus+does+not+respond+chemotactically+to+moderate+concentration+gradients.">Myxococcus xanthus does not respond chemotactically to moderate concentration gradients.</a> J Bacteriol. 154, 437-442 (1983).</li><li>Dworkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactic+behavior+of+Myxococcus+xanthus.">Tactic behavior of Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 154, 452-459 (1983).</li><li>Wu, S. S., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+expression+of+the+pilA+gene+in+Myxococcus+xanthus.">Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 179, 7748-7758 (1997).</li><li>Bustamante, V. H., Mart&#237;nez-Flores, I., Vlamakis, H. C., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Frz+signal+transduction+system+of+Myxococcus+xanthus+shows+the+importance+of+the+conserved+C-terminal+region+of+the+cytoplasmic+chemoreceptor+FrzCD+in+sensing+signals.">Analysis of the Frz signal transduction system of Myxococcus xanthus shows the importance of the conserved C-terminal region of the cytoplasmic chemoreceptor FrzCD in sensing signals.</a> Mol Microbiol. 53, 1501-1513 (2004).</li></ol>

Time-lapse microcinematography (TM) se ha convertido en un método estándar para el estudio de la motilidad procariotas 2-7. Tradicionalmente, la TM se lleva a cabo mediante el uso de mechas de papel de filtro, pastillas de finas agar, o agar losas como sustratos 08.11. Estos métodos son los adecuados y el coste efectivo cuando se usa para generar secuencias de imágenes de las ilustraciones general del movimiento de bacterias. Sin embargo, si las secuencias de imagen debe dar lugar a la generaci...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1.0% Casitone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5% yeast extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-sampling pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 &mu;l glass disposable tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 x 2 cm, 0.5-mm-thick silicone rubber gasket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grace Bio-Lab Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

recording multicellular behavior in myxococcus xanthus biofilms using time-lapse microcinematography

Un enjambre de la δ-proteobacteria xanthus Myxococcus contiene millones de células que actúan como un movimiento colectivo, coordinando a través de una serie de señales para crear patrones complejos, dinámicos, como respuesta a señales ambientales. Estos patrones son de auto-organización y emergentes, ya que no se puede predecir mediante la observación del comportamiento de las células individuales. Mediante un ensayo de microcinematography lapso de tiempo de seguimiento, se identificaron un patrón distinto emergente en M. xanthus llamado quimiotaxis, que se define como el movimiento dirigido de un enjambre de hasta un gradiente de nutrientes hacia su fuente 1. A fin de caracterizar de manera eficiente a través de la quimiotaxis microcinematography lapso de tiempo, hemos desarrollado un complejo altamente modificable placa (Figura 1) y construyó un grupo de 8 microscopios (Figura 2), cada uno capaz de capturar vídeos con lapso de tiempo. El ensayo es lo suficientemente riguroso como para permitir la replicación constante de datos cuantificables, y los videos resultantes nos permiten observar y rastrear cambios sutiles en el comportamiento de enjambre. Una vez capturados, los videos son trasladados a un equipo de análisis / almacenamiento con memoria suficiente para procesar y almacenar miles de videos. La flexibilidad de esta instalación ha demostrado ser útil para varios miembros de la M. xanthus comunidad.

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Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

Para el estudio de<em&gt; Myxococcus xanthus</em&gt; Comportamiento de enjambre, hemos diseñado un protocolo microcinematography lapso de tiempo que puede ser modificado para diferentes ensayos. Emplea a las condiciones normales de crecimiento adaptado para la microscopía, y con resultados reproducibles mediante el uso de empaques de bajo costo, de silicona reutilizables. Hemos utilizado este método para cuantificar la quimiotaxis multicelulares.

Registro del comportamiento multicelular en Myxococcus xanthus Las biopelículas con Time-lapse Microcinematography

A swarm of the &delta;-proteobacterium Myxococcus xanthus contains millions of cells that act as a collective, coordinating movement through a series of ...

recording-multicellular-behavior-myxococcus-xanthus-biofilms-using

Research

JoVE Journal

Biology

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

12.2K vistas.  University of South Carolina (USC). Para el estudio de Myxococcus xanthus Comportamiento de enjambre, hemos diseñado un protocolo microcinematography lapso de tiempo que puede ser modificado para diferentes ensayos. Emplea a las condiciones normales de crecimiento adaptado para la microscopía, y con resultados reproducibles mediante el uso de empaques de bajo costo, de silicona reutilizables. Hemos utilizado este método para cuantificar la quimiotaxis multicelulares.

Video: Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoreo de actina desmontaje con la Microscopía de Time-lapse

Investigación

Biología

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Análisis cuantitativo de la migración desordenada de las células mediante microscopía de Time-lapse vídeo

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

La medición cuantitativa de invadopodios mediada por proteolisis de la matriz extracelular en contextos simples y multicelulares

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

El uso de microscopía lapso de tiempo para Visualizar anoxia inducida animación suspendida en<em&gt; C. elegans</em&gt; Los embriones

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

La adquisición de fluorescencia Time-lapse películas de levadura en ciernes y el análisis de la dinámica de una sola célula con injertos

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualización de Desarrollo Craneofacial en los SOX10: Kaede pez cebra transgénico Línea Usando Time-lapse microscopía confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...