Esta investigación es apoyada por la Fundación Nacional para la Investigación y el Ministerio de Educación de Singapur en virtud de su Centro de Investigación del Programa de Excelencia, las ayudas para la instalación (M4330002.C70) de la Universidad Tecnológica de Nanyang, y ACRF Nivel 2 (MOE2014-T2-2-172) del Ministerio de Educación, Singapur. Los autores agradecen a Joey Yam Kuok Hoong por participar en la manifestación de este protocolo.

1. Biofilm Cultivo <ol><li> Preparación de Cepas bacterianas <ol><li> 1 día antes de la cultivación biofilm, preparar cultivos bacterianos planctónicas mediante la inoculación de 2 ml de medio de crecimiento apropiado de cultivo bacteriano congelado. Utilice medio Luria-Caldo (10 g L -1 NaCl, 10 g de extracto de L -1 levadura y 10 g L -1 triptona) para mucoide P. aeruginosa y sus PEL Δ Δ y PSL mutantes defectuosos. Incubar durante la noche a 37 ° C y 200 rpm de remoción condiciones. Diluir cultivos de una noche a un OD 600 de 0,40 utilizando un espectrofotómetro. </li><li> Ensamble de configuración de celda de flujo, que ha sido descrito previamente 14, preferiblemente en una estación móvil o carro que puede ser llevado a la sala de microscopio para obtener imágenes de la célula de flujo sin necesidad de desmontarlos. </li><li> Preparar el medio de cultivo estéril en 2 L o botellas de 5 litros por cada celda de flujo. Utilice un medio mínimo M9 (48 mM Na 2 HPO 4, 22 mMKH 2 PO 4, 19 mM NH 4 Cl, NaCl 9 mM, 2 mM MgSO 4, y 0,1 mM CaCl 2) suplementado con 0,04% de glucosa (peso / vol) y 0,2% (peso / vol) casaminoácidos) para P. aeruginosa fluya biofilms celulares. </li><li> Microesferas fluorescentes Alícuota en tubos de microcentrífuga y giran en H2O estéril durante 5 min en centrifugar a 9,391.2 g. Eliminar el sobrenadante y resuspender en 1 ml de medio de crecimiento para eliminar el sodio azida (desinfectante) antes de añadir al medio de crecimiento en 2 L o 5 botellas medianas L. NOTA: Diferentes tamaños de microesferas vienen en diferentes concentraciones y deben diluirse de acuerdo con las instrucciones. Por ejemplo, dispersar a 120 l de 1,0 micras de diámetro microesferas, 15 l de 0,5 micras microesferas de diámetro y 0,96 l de 0,2 micras de diámetro microesferas en 2 l de medio de crecimiento para dar 2,18 × 10 6 microesferas ml -1 para cada tamaño de partícula. </li><li> Coloque la botella medio a UPSTresma de celda de flujo y permitir que el medio de cultivo fluya a través de la configuración entera. Detenga el flujo e inyectar cultivos de una noche diluidas en cámaras celda de flujo. Permitir que las bacterias se adhieran al sustrato cubreobjetos durante 1 h antes de flujo de medio de crecimiento continua a una velocidad de flujo de aproximadamente 5,5 x 10 -3 m seg -1, o 8 rpm con una bomba peristáltica. NOTA: Las biopelículas son generalmente cultivadas a temperatura ambiente (25 ° C) durante 3-7 días. </li><li> Alternativamente, para la configuración de la cultura estática, diluir cultivos de una noche 100 veces en tubos de microcentrífuga, añadiendo 10 l de cultivo durante la noche a 1 ml de medio de crecimiento con partículas. Aumentar la concentración de partículas en el medio de crecimiento para cultivo estático en aproximadamente 500 veces en comparación con la utilizada para las biopelículas de flujo (por ejemplo, lavar y resuspender 600 l de 1.0 micras esferas de diámetro en 10 ml de medio de crecimiento) como biofilms celda de flujo están constantemente repone con partículas sino culturas estáticas no lo son. <ol><li> Añadir 2001; l de cultivo de una noche se diluyó con partículas a las cámaras de 8 diapositivas así. Se incuba a 37 ° C en condiciones estáticas. Las biopelículas son generalmente cultivadas durante 1 día. Reemplace el medio de cultivo gastado diariamente con medio de cultivo fresco con partículas si biofilm se cultiva desde hace más de 1 día. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Microscopía <ol><li> En el día 3 y 5, apague flujo de la bomba peristáltica y llevar configuración de celda de flujo en la sala de microscopía. Abrazadera de tubo cerca de la entrada y salida de las cámaras de la celda de flujo para prevenir la deriva (una causa error sistemático por los cambios en el medio ambiente) de flujo. Coloque la celda de flujo en la platina del microscopio de un microscopio vertical. NOTA: Utilice un microscopio invertido para obtener imágenes de los pocillos. </li><li> Utilice microscopía de fluorescencia con objetivo 40X aceite para grabar vídeos de movimiento de microesferas embebidas en el biofilm en varios lugares (microcolonias y capas diferenciadas planos) y en diferentes días (día 3 y 5) parainvestigaciones espaciales y temporales. Tome cortos vídeos con una mayor velocidad de fotogramas para investigar los acontecimientos que ocurren en escalas de tiempo cortas (por ejemplo, 1,5-3 vídeos min a velocidad de fotogramas de 25-50 cuadros por segundo para la dinámica de rápidos), y videos más largos con menor velocidad de fotogramas para investigar los acontecimientos en el tiempo más largo escalas (por ejemplo, vídeos de 15-30 min de velocidad de fotogramas de 2.5-5 cuadros / seg para una dinámica más lenta). NOTA: Un video contiene típicamente 5-10 partículas, y es típicamente de 1,0 a 2,5 GB de tamaño de archivo. Microcolonias más grandes pueden contener más partículas. Tome 5-10 vídeos para cada categoría (por ejemplo, 5-10 vídeos de diferentes microcolonias y de diferentes lugares en capas planas indiferenciadas). El biofilm tiene una arquitectura heterogénea que puede consistir en microcolonias, canales, vacíos y las capas planas indiferenciadas. </li><li> Guardar vídeos en formato adecuado que pueden ser leídos por Fiji / ImageJ (por ejemplo CZI, tif). </li><li> Compruebe los vídeos para la deriva desplazándose por vid acabadaeo y la observación de que las partículas no se mueven en la misma dirección al mismo tiempo. Drift puede ser causada por el movimiento z-etapa, las corrientes en la celda de flujo, el desequilibrio de la mesa de anti-vibración, presión de aire o cambios de temperatura. Menor correcta deriva utilizando técnicas de post-procesamiento normalmente se suministran con software microscopio. Deseche todos los vídeos que la deriva no se puede corregir. Registre los siguientes parámetros, que son necesarios durante el análisis de seguimiento de partículas: Resolución (píxeles / um), Número de Marcos, Duración. </li><li> Retire la celda de flujo de platina del microscopio y reinicie la bomba peristáltica para seguir cultivando la biopelícula. </li></ol> 3. Análisis de seguimiento de partículas <ol><li> Obtener trayectorias de las partículas utilizando el plug-in TrackMate en software de código abierto (ImageJ). Descarga Fiji en <a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji.</a> Abra el video con Fiji y en el menú Plugins, seleccione Seguimiento y TrackMate. </li><li> Compruebe o ajuste la configuración en °e ventana sugiriendo ajustes iniciales de calibración para que coincida con los parámetros de vídeo como se registra en el paso 2.4. </li><li> Detectar partículas en TrackMate usando ImageJ. <ol><li> Seleccione &#39;detector de log&#39;, diámetro de partícula de entrada y el valor umbral (por ejemplo, 1000). Desplazarse por el video, mientras que al hacer clic en el botón &#39;Vista previa&#39; para comprobar que los círculos morados siguen las partículas a lo largo del vídeo. Ajuste los valores de diámetro y de umbral, según sea necesario: aumentar el valor umbral si círculos de color púrpura aparecen en el espacio vacío. Reducir el valor de umbral si se detectan partículas no suficientes. Haga clic en el botón al lado de completar la detección de las partículas. </li><li> Haga clic en el botón al lado cuando se le presenta la opción para agregar o quitar las partículas detectadas en &#39;umbral inicial&#39;, &#39;Seleccione una vista&#39; y &#39;Seleccionar un filtro&#39; ventanas continúen sin ajuste si la detección inicial de partículas fue satisfactoria. </li><li> Seleccione &#39;rastreador LAP simple&#39; en el optien la barra de &quot;Seleccionar un método de seguimiento&quot; ventana como partículas rara vez se mueven fuera de foco en el biofilm y se realiza un seguimiento fácilmente. Utilice los valores máximo distancia de enlace sugerido o baja y la brecha de cierre automático y haga clic en siguiente. </li><li> Compruebe que el seguimiento de las partículas es satisfactoria desplazándose por el video para ver que las partículas siguen las pistas dibujadas por TrackMate, y que no hay pistas deseadas o faltantes. Saltear las diversas etapas de filtrado. Ir a la última ventana &quot;Seleccione una acción &#39;. Seleccione &#39;pistas de exportación a archivo xml&#39; desde el menú desplegable y haga clic en &quot;Ejecutar&quot;. Elija una carpeta para guardar las pistas. NOTA: Hay varios programas disponibles en el dominio público para el análisis de trayectorias de las partículas y el uso de microrheology. msdanalyzer y TrackArt son ejemplos de partículas seguimiento de programas de análisis que se ejecutan en el entorno Matlab. </li></ol></li><li> Preparar Matlab para importar las trayectorias de las partículas en los archivos xml seleccionando en el menú deMatlab Archivo&gt; Ruta Set ... y poner la carpeta de scripts disponibles con el paquete de Fiji. </li><li> Para analizar las trayectorias de las partículas con msdanalyzer, descargue el enlace al archivo zip o el archivo tar.gz at <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories</a> . <ol><li> Extraer la carpetamsdanalyzer 15 y colóquelo en una carpeta que pertenece a la ruta de Matlab (por ejemplo C: Documents and Settings &lt;nombre de usuario&gt; Mis documentos Matlab). Comience Matlab e iniciar el analizador escribiendo: ma = msdanalyzer (2, &#39;um&#39;, &#39;s&#39;) donde um y sec son las unidades de espacio y tiempo físicos en el video. <ol><li> Importe las trayectorias de las partículas escribiendo: [pistas, md] = importTrackMateTracks (&#39;nombre_de_archivo.xml&#39;, &#39;Clipz&#39;;, &#39;Scalet&#39;) ma = ma.addAll (pistas); donde &#39;Clipz&#39; elimina la dimensión z un vídeo 2D, y &#39;Scalet&#39;. </li><li> Trazar las trayectorias Onto gráfico usando: ma.plotTracks; ma.labelPlotTracks; </li><li> Calcular los TME de las partículas usando: ma = ma.computeMSD; ma.msd </li><li> Trazar los TME de cada partícula: cifra ma.plotMSD </li><li> Combine trayectorias de las partículas de otros vídeos de la misma categery (por ejemplo, partículas incrustadas en microcolonias de tipo salvaje en el día 3) repitiendo 3.5.1.1 a 3.5.1.4). </li><li> Trazar la media del conjunto o de la media de todas las curvas: ma.plotMeanMSD Cambiar el y- y el eje x de lineal a escala logarítmica. En tiempos de retardo largos, las curvas se vuelven MSD ruidoso debido a la insuficiencia de las estadísticas en los plazos más largos. Las curvas de MSD también pueden elevarse abruptamente debido a un error dinámica. Estas regiones de la curva se pueden eliminar mediante el uso de la herramienta de pincelpara seleccionar el final de la curva y seleccionando &#39;El cepillado&#39;&gt; &#39;Eliminar sin cepillar&#39; en el menú Herramientas. </li></ol></li><li> Descarga Ezyfit en <a href="http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/">http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/</a> y añadir Ezyfit a una carpeta que pertenece a la trayectoria Matlab (por ejemplo C: Documents and Settings &lt;nombre de usuario&gt; Mis documentos Matlab). Instale el menú Ezyfit escribiendo en Matlab espacio de trabajo efmenu instalación. Reinicie MATLAB con el menú Ezyfit en la ventana de la figura. Ajustar las curvas de MSD a la ley de potencia seleccionando en el menú Ezyfit &#39;Mostrar Fit&#39;&gt; &#39;Power&#39;&gt; &#39;a * x ^ n&#39; eran n es el exponente de difusión estimada α. NOTA: msdanalyzer requiere el Curve Fitting Toolbox de Matlab para el ajuste de las curvas de MSD. Ezyfit es una alternativa y el software libre que puede realizar el ajuste de curvas. </li><li> Borrar trayectorias de las partículas actuales y los TME para calcular nuevos TME partículas en otros lugares o tiempo: claro </li&gt; <li> Después del cálculo de varias curvas medias MSD de partículas en un medio (control), y microcolonias y áreas diferenciadas de varias cepas, copiar y pegar las curvas en un gráfico para la comparación. La rigidez de la muestra y aumentar la reticulación con valores más bajos de MSD. Curvas planas tienen menores α y la muestra es más elástica que curvas más pronunciadas con mayor α. </li><li> Seleccione la curva e ir a &quot;Herramientas&quot; para mirar las estadísticas de datos, como la mediana y el rango. El MSD del talón es proporcional a la deformación por fluencia, J (t) del material en el que el cordón está incrustado según la relación, <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/53093/53093eq1.jpg" /> donde J = deformación por fluencia, d = diámetro de las partículas, k B = constante de Boltzman, T = temperatura y t = tiempo. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Microrheology es una herramienta útil para las mediciones reológicas locales en sistemas heterogéneos, tales como las biopelículas microbianas. Es una técnica no destructiva, lo que permite la supervisión en tiempo real de los cambios reológicos dentro de la misma muestra biológica a través de múltiples puntos de tiempo. En este protocolo, microrheology partícula de seguimiento se aplicó a Pel y los mutantes de exopolisacáridos Psl el fin de investigar cómo afectan a la elasticidad y la reticulación efica...

La mayoría de las células bacterianas son capaces de emplear tanto (sésiles) Modos adjunta a la superficie de crecimiento 1 planctónica (de vida libre) y. En el modo unido a la superficie de crecimiento, las células bacterianas secretan y encierran a sí mismos en grandes cantidades de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) para formar biopelículas. La EPS se compone principalmente de proteínas, exopolisacáridos, ADN extracelular y es esencial para la formación de biopelículas 2. Sirve como un andamio físico por el cual las bacterias pueden utilizar para diferenciar espacialmente y protege a las bacterias de las condiciones ambientales nocivas y las respuestas del huésped. Los diferentes componentes de EPS tienen papeles distintos en la formación de biopelículas 3 y los cambios en la expresión de los componentes de EPS puede remodelar radicalmente las estructuras biofilm 4. Componentes EPS también pueden funcionar como moléculas de señalización 5, y estudios recientes han mostrado ciertos componentes EPS que interactúan con las células microbianas para guiar sus diff migración y biofilmerentiation 6-8. La investigación sobre la EPS en gran medida se ha avanzado sobre la base de los análisis morfológicos de los biofilms producidos por mutantes defectuosos en un componente específico de la EPS 9,10. Además, el EPS se caracteriza generalmente en la escala macro (caracterización granel) 11. Morfológica analiza sin embargo puede faltar detalle cuantitativa y caracterización mayor, que devuelve valores medios, pierde el detalle que existe dentro de la heterogeneidad de la biopelícula. En la actualidad existe una creciente tendencia a progresar a la caracterización en tiempo real de las propiedades mecánicas de la EPS en la escala micro. Este protocolo se muestra cómo microrheology partícula de seguimiento es capaz de determinar los efectos espacio-temporales de componentes de la matriz Pel y exopolisacáridos Psl en la viscoelasticidad y eficaz reticulación de Pseudomonas aeruginosa biofilms 4. Microrheology pasiva es una rh simple y baratoeology método que proporciona el más alto rendimiento del muestreo microrheological espacial de un material hasta la fecha 12,13. En microrheology pasiva, esferas de sondas se colocan en la muestra y su movimiento Browniano, impulsado por energías térmicas (k B T) es seguido por microscopía de vídeo. Varios partículas pueden ser rastreados de forma simultánea, y las coordenadas de tiempo-dependiente de las partículas siguen un camino aleatorio convencional. Por lo tanto, en promedio, las partículas se mantienen en la misma posición. Sin embargo, la desviación estándar de los desplazamientos o la media al cuadrado de desplazamiento (MSD) de las partículas, no es cero. Desde fluidos viscosos fluyen, la partícula MSD en un fluido viscoso crece linealmente a medida que pasa el tiempo. En contraste, la reticulación polimérico encuentra en viscoelástico o sustancias elásticas les ayuda a resistir el flujo, y las partículas se convierten limitada en su desplazamiento, que conduce a las mesetas de la curva de MSD (Figura 1A). Esta observación se deduce la relación MSDαt <sup&gt; α, donde α es el exponente de difusión que se relaciona proporción de contribuciones elásticas y viscosas de la sustancia. Para partículas que se mueven en los fluidos viscosos a = 1, en ​​sustancias viscoelásticas 0 &lt;α &lt;1, y en sustancias elásticas α = 0. El MSD también puede ser usada para calcular la deformación por fluencia, que es la tendencia del material se deforme permanentemente sobre tiempo y calcula cómo fácilmente un diferenciales materiales. La química tamaño, la densidad y la superficie de la partícula son críticos para la correcta aplicación de experimento microrheological y se eligen con respecto al sistema estudiado (en este caso los polímeros de la matriz del biofilm, véase la Figura 1B). En primer lugar, la partícula mide la reología de la sustancia con estructuras que son mucho más pequeño que la propia partícula. Si las estructuras de la sustancia son de escala similar a la partícula, el movimiento del partícu es perturbado por la forma y orientación de las estructuras individuales. Sin embargo, si las estructuras que rodean la partícula son mucho más pequeños, este efecto es pequeño y promedio, la presentación de un entorno homogéneo a la partícula (Figura 1B). En segundo lugar, la densidad de la partícula debe ser similar al del medio (1.05 g ml -1 para medios a base de agua) de tal manera que se evita la sedimentación y las fuerzas de inercia son insignificantes. La mayoría de las partículas con celosías de poliestireno cumplen los criterios anteriores. Idealmente, la partícula no interactúa con los polímeros de la matriz de la biopelícula como la interpretación reológico de MSD partícula sólo es válida si el movimiento es aleatorio, impulsada por la energía térmica y la colisión con estructuras de sustancias. Esto se puede observar mediante la comprobación de la partícula sonda tiende a obligar o rebotar en la superficie de un biofilm pre-adulto. Sin embargo, a pesar de la falta de atracción por el biofilm, las partículas deben ser capaces de ser incorporados a la matriz.Además, la heterogeneidad físico-químico de la biopelícula puede resultar en diferentes partículas siendo más adecuado como sondas en diferentes regiones del biofilm. De este modo, las partículas de diferentes tamaños y química de la superficie deben aplicarse a la biopelícula. Como tal, la partícula MSD es capaz de proporcionar información útil sobre cómo los diferentes componentes contribuyen a la reología y la difusión de la biopelícula. Además, el uso de diferentes sondas le permite a uno para derivar información sobre la heterogeneidad espacial fisicoquímica de la biopelícula. Este método puede ser utilizado para probar el tratamiento antimicrobiano efecto sobre las propiedades mecánicas de la biopelícula, o aplicarse a las biopelículas de especies mixtas para investigar cómo las propiedades mecánicas de la biopelícula se cambian de la introducción de otra especie. Partículas TME también puede ser útil para la caracterización de la dispersión de la biopelícula. Tales estudios serían útiles en la comprensión de los biofilms, lo que podría mejorar los tratamientos biofilm unnd ingeniería de biofilms para actividades útiles.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-8821</td>
			<td>1.0 um red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager M1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive 07523-80</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07523-80</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell Chambers</td>
			<td colspan="3">Technical University of Denmark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td colspan="3">Technical University of Denmark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear polypropylene plastic connectors&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06365-83</td>
			<td>1/16 in. (1.588 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binder Clips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To clamp tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td colspan="2">Thermo Scientific&#8482; Nunc&#8482;</td>
			<td>50 x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 3 mL</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L Storage/Media Bottles</td>
			<td>VWR&#174;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolley</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To hold biofilm setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ mapping of the mechanical properties of biofilms by particle-tracking microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

Las propiedades viscoelásticas locales de la biopelícula en diferentes regiones de la biopelícula, que incluía los huecos (medianas por encima de la biopelícula), llanuras (capa plana indiferenciado de células) y microcolonias (véase etiquetas en la Figura 2A) fueron investigados. Los cambios temporales en propiedades viscoelásticas del biofilm durante la maduración de 3 días a 5 también se determinaron. El MSD de las partículas en los huecos se utilizó como control y comparable a la MSD de...

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In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

En Mapping in situ de las propiedades mecánicas de biopelículas por partículas de seguimiento Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

9.6K vistas.  Nanyang Technological University. Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparamétrico óptico Cartografía del corazón de conejo Langendorff perfundidos

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Investigación

Bioingeniería

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mapeo óptico de potenciales de acción y transitorios de calcio en el corazón de ratón

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

La cuantificación de las propiedades mecánicas de la glicocálix endotelial con la Microscopía de Fuerza Atómica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in these structures are held together by physical interactions mediated by a network of extracellular polymeric substances. Bacterial biofilms impact many human activities and the understanding of their properties is crucial for a better control of their development &#8212; maintenance or eradication &#8212; depending on their adverse or beneficial outcome. This paper describes a novel methodology aiming to measure in situ the local physical properties of the biofilm that had been, until now, examined only from a macroscopic and homogeneous material perspective. The experiment described here&#160;involves introducing magnetic particles into a growing biofilm to seed local probes that can be remotely actuated without disturbing the structural properties of the biofilm. Dedicated magnetic tweezers were developed to exert a defined force on each particle embedded in the biofilm. The setup is mounted on the stage of a microscope to enable the&#160;recording of time-lapse images of the particle-pulling period. The particle trajectories are then extracted from the pulling sequence and the local viscoelastic parameters are derived from each particle displacement curve, thereby providing the 3D-spatial distribution of the parameters. Gaining insights into the biofilm mechanical profile is essential from an engineer&#39;s point of view for biofilm control purposes but also from a fundamental perspective to clarify the relationship between the architectural properties and the specific biology of these structures.

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

This paper shows an original methodology based on the remote actuation of magnetic particles seeded in a bacterial biofilm and the development of dedicated magnetic tweezers to measure in situ the local mechanical properties of the complex living material built by micro-organisms at interfaces.

El accionamiento a distancia magnética del micrométrica Sondas para<em&gt; In situ</em&gt; Mapping 3D bacterianas Biofilm Propiedades Físicas

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Investigación De La Separación De Flujo Tridimensional Inducida Por Un Pólipo Modelo De Pliegue Vocal

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

Medida longitudinal de la matriz extracelular Rigidez en modelos de tumores en 3D utilizando partículas de seguimiento Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Órgano Cultura Modelo Murino del disco intervertebral

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

Un milímetro a la flexión prueba sistema de la escala para medir las propiedades mecánicas de espículas de esponja marina

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

Un protocolo para el seguimiento en tiempo real 3D sola partícula

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...