Este protocolo permite a los investigadores en el campo craneofacial comparar cuantitativamente los atributos de movimiento colectivo en células de control y mutantes como un medio para comprender la remodelación mesenquimal durante la elevación de la plataforma palatina. El uso de células mesenquimales palatinas embrionarias primarias de ratón y las imágenes de lapso de tiempo proporcionan un método proxy accesible para evaluar la dinámica de elevación de la plataforma palatina. Para cosechar conchas palatales de un embrión de ratón, use una cuchara perforada esterilizada para colocar un embrión embrionario de día 13.5 en un plato estéril de 10 centímetros lleno de medio de cultivo MEPM estéril bajo un microscopio estereoscópico.
Después de la decapitación, inserte una punta de un forrórceps No.5 fino esterilizado en la boca justo dentro de la mejilla y empuje la punta de los forrórceps hasta que salga de la parte posterior del cráneo. Oriente las pinzas de modo que el otro brazo se cierne justo sobre el canal auditivo antes de pellizcar las pinzas cerradas para cortar el tejido. Repita la incisión en el otro lado de la cabeza, continuando el procedimiento de corte por pellizco hasta que se hayan extirpado la mandíbula inferior, la lengua y la parte inferior del cráneo, exponiendo los estantes palatales.
Con la cabeza colocada de lado, coloque las puntas de un par de tijeras pequeñas, estériles de acero inoxidable delante y detrás del cráneo justo al nivel del ojo del embrión y corte justo por encima de los ojos para eliminar el cráneo del cráneo, creando una superficie plana. A continuación, coloque la cabeza boca abajo con el aspecto superior descansando plano en la parte inferior del plato y ubique los estantes palatales, que deben ser visibles como dos puentes elevados a cada lado de la ranura central en la mitad anterior de la cabeza. Para asegurar la cabeza al plato, inserte una punta de una fórceps fina a través del tejido cerca de la región nasal de la cabeza anterior a los estantes palatales, y la otra a través de la base del cráneo posterior a los estantes palatales.
Inserte ambos puntos de un segundo par de pinzas muy afiladas y finas en el tejido en la base de la superficie lateral del estante y pellizque lenta y cuidadosamente para cortar el tejido. Repita la incisión a lo largo de la base de la superficie medial del estante y en los extremos anterior y posterior del estante para separar el estante de su fijación a la cabeza, luego levante suavemente el estante, haciendo pellizcos adicionales según sea necesario para liberar completamente la cáscara del tejido circundante. Cuando el segundo estante palatal se haya eliminado de la misma manera, use una pipeta de transferencia de bulbo de plástico estéril para transferir los estantes a un tubo de microcentrífuga estéril de 1.5 mililitros en aproximadamente 500 microlitros de PBS en hielo.
Para establecer un cultivo celular MEPM, cuando se hayan recolectado todos los estantes, aspire el PBS sin alterar los tejidos e inmediatamente agregue 200 microlitros de 37 grados Celsius 0.25% tripsina a cada tubo de tejido de estante palatal. Use una pipeta de 1. 000 microlitros para pipetear brevemente los tejidos varias veces e incubar los tejidos durante 10 minutos a 37 grados centígrados, pipeteando brevemente después de cinco minutos. Al final de la incubación, pipetear los tejidos nuevamente antes de agregar 800 microlitros de medio de cultivo MEPM a cada tubo y centrifugar los tubos para recolectar las células.
Después de aspirar el sobrenadante, resusped los gránulos en un mililitro de medio de cultivo MEPM fresco por tubo, y platear las células en pozos individuales de una placa tratada con cultivo de tejido de seis pozos que contiene dos mililitros por pozo hasta un total final de tres mililitros por pozo, luego permita que las células se adhieran a la superficie plástica durante 12 horas en una incubadora de cultivo celular estéril. Para configurar un ensayo de migración colectiva 2D, retire la parte superior de un inserto de silicona estéril de dos pomos a una altura de aproximadamente un milímetro por cada muestra que se analizará y use torceps estériles para colocar los insertos de dos pomos estériles acortados en el centro de los pozos individuales de una placa de seis pomos. Presione hacia abajo a lo largo de todos los bordes para asegurarse de que los insertos estén completamente adheridos a los fondos de los pozos y sepeche 300 células MEPM por milímetro cuadrado de los insertos de silicona acortados en un volumen total de 40 a 50 microlitros de medio de cultivo MEPM en cada inserto para una incubación nocturna en la incubadora de cultivo celular.
Para configurar un ensayo de reparación de heridas, use forrórceps estériles para colocar un inserto de silicona estéril de dos pomos sin modificar en el centro de un pomo de una placa de seis pomos por muestra y presione firmemente los bordes del inserto para unir el inserto a la placa de cultivo. Luego secueste 1, 400 células por milímetro cuadrado en 100 microlitros de medio de cultivo MEPM en cada inserto e incube las células durante 48 horas en el medio de cultivo celular. Al realizar un ensayo de migración colectiva 2D, la siembra de las células en insertos de silicona de dos pozos en una placa de cultivo grande generalmente proporciona una mejor densidad celular para la obtención de imágenes.
Los pequeños anillos impresos en 3D colocados en un plato de 35 milímetros también se pueden utilizar para el análisis de motilidad 2D. Para los ensayos de reparación de heridas, las células se cultivan en insertos de silicona de dos pozos hasta la alta confluencia. Luego se retiran los insertos y se extrae la imagen de la herida hasta el cierre.
Las trayectorias de MEPM son persistentes y la dirección de la motilidad celular se mantiene durante varias horas. El análisis de desplazamiento medio versus tiempo indica que la persistencia en forma de desplazamiento es proporcional al tiempo transcurrido. El análisis de flujo de los datos de motilidad revela que los grupos de células MEPM que se mueven juntos tienen un tamaño aproximado de 300 micras.
También se observa una profunda diferencia de motilidad entre las células MEPM de tipo salvaje y mutantes. Este procedimiento podría usarse en varias líneas de ratones transgénicos y para tratar células MEPM con varios reactivos bioquímicos para estudiar sus efectos sobre el movimiento celular. Nos hemos centrado en las células del mesénquima palatal primario, pero las imágenes de lapso de tiempo y los análisis cuantitativos también se pueden utilizar para explorar los atributos de migración de cualquier tipo de célula móvil en procesos dinámicos de desarrollo.
