Los autores desean agradecer a Amanda Struckhoff para la ayuda inicial con el experimento. Este trabajo fue apoyado por una beca del NIH 5RO1CA115706.

1. Preparación de la placa recubierta de colágeno <ol><li> Diluir colágeno a una concentración final de 10 mg / ml en medio Opti-Mem medios. </li><li> Escudo 6 y placas con colágeno, mediante la adición de 1,5 ml de la etapa 1 a cada pocillo. Incubar toda la noche a 4 ° C. </li><li> Al día siguiente, se lava la placa 2 veces con fosfato 1x buffer salino (PBS) y almacenarlos en PBS. </li></ol> 2. Preparación y la siembra de células en una placa de 6 pocillos Nota: Utilizar los medios cálidos y PBS para garantizar las condiciones óptimas para el movimiento celular <ol><li> Crecer MDA-MB-231 (un cáncer invasivo de mama línea celular) escasamente en Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) con fetal al 10% de suero bovino (FBS). En este ejemplo, se utiliza el MDA-MB-231, sin embargo, este método puede ser aplicado a todas las líneas de células adherentes cancerosas y no cancerosas. </li><li> Lave las células dos veces con PBS caliente 1x y cobrar por tripsinización. Revise las células bajo un microscopio para hacer Sure que las células estén debidamente separados por tratamiento con tripsina. </li><li> Recoger las células mediante la adición de medio DMEM con FBS al 10%, de girar suavemente las células a 1000 g durante 5 minutos. Resuspender el sedimento celular suavemente en medio DMEM con FBS al 10%. </li><li> Romper el pellet de células pipeteando arriba y hacia abajo con suavidad. Es importante para romper grupos de células en células individuales tanto como sea posible. </li><li> Cuenta las células y se diluye hasta una concentración final de 50.000 células / ml en medio DMEM con FBS al 10%. Dispensar 2 ml en cada pocillo. </li><li> Incubar la placa a 37 ° C en un incubador de cultivo de tejido durante la noche, hasta que empiece la microscopía de lapso de tiempo. </li><li> Para asegurar un amplio espacio para la migración, crear una herida utilizando una punta de pipeta, lavar la placa con 1X PBS para eliminar los desechos (formado como resultado de la herida) y añadir DMEM con FBS al 10%. Revise debajo del microscopio para detectar células flotantes. Si un gran número de células son flotantes, repita el procedimiento de lavado. Ahora, la placa está lista para ser montado en elmicroscopio para la adquisición de la imagen. </li></ol> 3. Microscopio de instalación y adquisición de imágenes automatizada Hay varios paquetes de software de imagen que controlan el microscopio para la adquisición de imagen automatizado. Aquí, nosotros usamos Slidebook 5,0 software de imágenes y adquisiciones automáticas se realizan en un microscopio Olympus (Olympus IX81), acoplado a una cámara de EM-Hamamatsu C9100, que es excelente para células vivas, las aplicaciones donde la velocidad de adquisición y fototoxicidad mínima es de suma importancia. El sistema incluye una etapa superior de la cámara de control ambiental (Neue células vivas) y un sistema automatizado de control XY etapa (Antes Proscan). Las imágenes se adquieren con un 10 veces UPLANFL Ph1/0.30 objetivo, en el modo de campo claro, con un intervalo de tiempo definido. El siguiente protocolo describe la adquisición de la imagen. <ol><li> Encienda el microscopio, la cámara, y un aparato celular en vivo de imágenes. Coloque la placa sobre la fase microscópica. Cubrir la placa por el entorno de la célula Neue vivoambiental cámara de control, que está conectado con una fuente de CO 2 y sensores de temperatura. Ajuste el termostato a 37 ° C y el CO 2 al 5%. </li><li> SlideBook software permite la selección objetiva completamente automatizada, la selección de longitud de onda y cambiar fácilmente entre las técnicas de campo fluorescentes y brillantes. Con el fin de configurar los diferentes parámetros de control de enfoque, de software libre SlideBook&gt; ir a la barra de menú de control&gt; centro de selección, haciendo clic&gt; <img alt="Figura 0 Botón 1" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig0btn1.jpg" /> y seleccionar los parámetros siguientes: <ol><li> En el &quot;cuadro de objetivos&quot;, definir el objetivo por la selección de la ventana desplegable. Tenga en cuenta que estamos utilizando un objetivo de la fase y han seleccionado manualmente el anillo de fase apropiada en el condensador. Si se utiliza un sistema con un condensador automatizado, esto se ajusta automáticamente a través del programa de software. Alternativamente, si no porta objetivos, ni del condensador se automatizan estos deben ser seleccionados de cada manual demente. </li><li> En el &quot;Set Filter&quot;: <ol><li> Seleccione los ajustes para dirigir la trayectoria de la luz ya sea el ocular o la cámara en el menú desplegable para ver los filtros disponibles (&quot;en vivo&quot; para el ocular, &quot;campo amplio&quot; para la cámara en nuestro sistema). </li><li> Seleccione el filtro adecuado para iluminación de campo claro (en la puesta en marcha, esta opción tiene la etiqueta &quot;DIC&quot;, que representa una posición abierta para el paso de luz claro). </li><li> Seleccione la fuente de luz, haga clic en &quot;Abrir brillante&quot; para abrir el obturador de campo claro. </li></ol></li></ol></li><li> Para ver la muestra en el ocular, seleccione el filtro de campo claro (posición &quot;6&quot; en nuestro sistema) en la torreta. Después de comenzar a ver la muestra a través del ocular para encontrar campos correspondientes y llevar la muestra en el foco (pasos 3.2.1 a 3.2.2.3). Mueva la torre de filtro para cambiar la trayectoria de la luz a la cámara para la captura de la imagen (la posición &quot;1&quot; en nuestro sistema). </li><li> La etapa automatizado permite la selección de diferentes coordinación XYTes para capturar varios campos de interés durante la adquisición de la imagen. En el software SlideBook, vaya al control de enfoque, seleccione &quot;XY&quot;, seleccione diferentes posiciones aunque el ocular, a continuación, haga clic en &quot;set point&quot; de bloqueo en cada lugar de la captura de imágenes (Figura 1). </li><li> Ajuste el foco de la imagen de la cámara que se visualiza en la pantalla. Esto se puede lograr ya sea usando los controles manuales en el microscopio o los controles de ordenador, que puede ajustar el enfoque en incrementos mucho más finos. </li><li> Uso de los controles en el &quot;orientar los controles&quot; de la ventana, ajustar la posición z de la etapa. Para obtener los mejores resultados, se centran en planos protuberancias celulares cerca del contacto con la placa. </li><li> Para ayudar a enfocar utilizar el control deslizante para ajustar los tiempos de exposición a estar en un rango apropiado para el enfoque. Si hay varias posiciones XY han sido seleccionados, ajustar el enfoque para cada posición individual: Bajo el control de foco&gt; XY punto de visita&gt;. Nota: esto se hace para asegurarse de que, then los campos están correctamente enfocado para una instantánea óptima. </li><li> Utilice el software para configurar los parámetros de captura de la ventana. En SlideBook, abra la captura por parte de la selección <img alt="Figura 0 Botón 2" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig0btn2.jpg" /> la barra de menús. Véase la Figura 2. A continuación, compruebe los siguientes parámetros. <ol><li> Compruebe Captura&gt; tipo como lapso de tiempo. </li><li> Revisión del filtro de serie: campo amplio: DIC (para la imagen de campo claro). </li><li> &quot;Tiempo transcurrido captura&quot; es el número de puntos de tiempo que va a ser capturado (que puede variar, dependiendo del tipo de célula). La duración es la duración total del tiempo para el experimento. Unidades de tiempo [en milisegundos (ms), segundos (s), minutos (m) u horas (h)] se puede seleccionar en el menú desplegable. </li><li> &quot;Intervalo&quot; es el retraso entre el inicio de un punto de tiempo y el comienzo del punto de tiempo siguiente. A medida que escribe en dos de estos valores, el tercer campo se calculará automáticamente. </li><li> Múltiple captura XY: Seleccione &quot;multilista de puntos &quot;para la posición XY más de 1. </li><li> Nombre del archivo. En el ejemplo dado, lo hemos llamado &#39;231 &#39;. </li></ol></li><li> Para evitar el inesperado cierre de la computadora debido a varias imágenes, utilice la &quot;opción del carrete&quot; para guardar el archivo. Es opcional, sin embargo es altamente recomendable. Para ello, en virtud de la captura de contro l&gt; seleccione Opciones avanzadas&gt; Carrete&gt; Capturar a la memoria y guardar en el archivo de cola después de cada punto de tiempo. Navegar por la ubicación para guardar el archivo de libreta de diapositiva (Figura 3). La película generada puede ser importado más tarde desde el lugar designado. Pasos de configuración del microscopio se ha resumido en <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/Figure_3.1_merged.pdf" target="_blank">el archivo 3.1</a> . </li></ol> 4. Procesamiento de imágenes y análisis de la migración: Cálculo de la velocidad y desplazamiento En este ejemplo, el procesamiento de imágenes se realiza por SlideBook 5, 6 5.0. Hay varios otros programas, como ImageJ 7 para el procesamiento de imágenes y análisis. <ol><li> Importe los archivos generados a partir de SlideBook imágenes de campos diferentes en diversos puntos temporales. Ir a la barra de menú&gt; en Imagen&gt; Importar&gt; libro de diapositivas cola&gt; seleccione el archivo deseado (Figura 4a). </li><li> Aquí nuestro objetivo es seguir el movimiento de las células individuales. Se puede hacer mediante el seguimiento automático o de seguimiento individual. En el ejemplo, hemos utilizado seguimiento manual, ya que esto facilita descartar artefactos fácilmente, lo que es más difícil con seguimiento automático. </li><li> Abra el archivo SlideBook, en el que tenemos que realizar un seguimiento. En el menú: Select Mask&gt; Protocolo de rastreo de partículas&gt; Protocolo de partículas manual de seguimiento (Figura 4b). Aparecerá una ventana con los puntos de tiempo de inicio y fin (Figura 4C). </li><li> Begin para seguir el movimiento de las células individuales haciendo clic en el centro de cada célula (núcleo). Realizar un seguimiento de aproximadamente 10 células de cada película y al menos tres películas diferentes deben ser seleccionados de diferentes lugares, para que aproximadamente 30 células se analizará desde un experimento. Cada experimento se repitió tres veces. Para permitir un enfoque imparcial, seleccione las celdas de diferentes lugares, como algunas células de la parte frontal, media, etc esquinas Haga clic en &quot;Aceptar&quot;, una vez que se realiza el seguimiento. </li><li> La migración al azar puede ser analizado mediante la medición de los cambios en la velocidad, etc, la velocidad o el desplazamiento Para analizar los datos, bajo el menú&gt; Select Mask&gt; rastreo de partículas&gt; protocolo de seguimiento de partículas. Seleccione parámetros de seguimiento como se describe, a continuación: (Figura 5a): <ol><li> Pista con - Seleccione el parámetro que desea seguir en la lista desplegable. En este ejemplo, hemos utilizado, el centro del área (las coordenadas del centro de la Obproyecto). </li><li> Haga clic en &quot;seguir y seguir&quot;. Una vez que el seguimiento se ha completado, este avanzará automáticamente a la siguiente etapa. </li></ol></li><li> Seleccione las estadísticas deseadas para cada ruta, como el desplazamiento y la velocidad media (ver Figura 5b): <ol><li> Promedio de velocidad - la distancia total recorrida dividida por el tiempo necesario para recorrer esa distancia. </li><li> Desplazamiento total - la distancia total recorrida por el objeto. </li><li> Haga clic en &quot;Calcular y continuar&quot; si desea pasar a la etapa siguiente, o simplemente seleccionar &quot;Calcular&quot; si desea ver las estadísticas sin tener que ir al siguiente paso. Un archivo que se genera se pueden guardar como archivo de texto y más tarde se pueden exportar a Excel. </li></ol></li><li> Con el fin de realizar un seguimiento de los objetos que utilizan un protocolo de seguimiento automatizado, en primer lugar una máscara tiene que ser creado. <ol><li> Seleccione la máscara de la imagen&gt; Segmento&gt; una ventana del segmento parece&gt; seleccionar hasta que se alcanza el umbral de tal manera que septiembrearating un objeto a partir de otros&gt; haga clic en Aplicar&gt; Aceptar (vea la Figura 5c). Paso 4.5.1 es el mismo. </li><li> Eliminar objetos más pequeños que - Marque esta casilla para eliminar de forma selectiva los objetos más pequeños que un determinado tamaño. Introduzca el tamaño en el campo de edición y elija micras o píxeles como unidad. Esto se utiliza para eliminar artefactos frecuencia causados ​​por los desechos. </li><li> Movimiento mínimo - introduzca el número mínimo de puntos de tiempo que debe ser rastreados para determinar una ruta de acceso. </li><li> Movimiento máximo - Entrar en el movimiento máximo que puede esperar de un objeto dado desde el punto de tiempo de uno a otro. </li><li> Pasos para analizar los datos son los mismos que el seguimiento manual (ver los pasos a 4.5.2 4.6.2). </li></ol></li></ol> 5. Los resultados representativos Un ejemplo de un análisis de la migración al azar como se cuantifica en términos de velocidad y desplazamiento (Figura 6). Después de exportar el archivo de to Excel, los datos se representa mediante un cuadro de bigotes y la trama. El análisis estadístico comparando el desplazamiento total y la velocidad media entre la prueba y el control se realiza a través de Mann-Whitney. La muestra de ensayo muestra un aumento de la velocidad media, en comparación con el control. La muestra de ensayo muestra un incremento de desplazamiento total en comparación con el control. Película de control y de prueba: Control de la MDA-MB-231 y la prueba de la MDA-MB-231 células fueron sembradas en el colágeno durante la noche. Lapso de tiempo microscopía de vídeo se realizó mediante microscopio Olympus, acoplado a una cámara EM-Hamamatsu. Las imágenes son tomadas en un intervalo de 1 hora para un total de 18 horas durante la migración al azar. Por favor, vea la película y una película de 2 de migración al azar para el control y las muestras de ensayo. Microscopio de configuración: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig1.jpg" /> Figura 1. Configuración de múltiples puntos de la imagen<html> capturar. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig2.jpg" /> Figura 2. Pasos que representan el control de la captura. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig3.jpg" /> Figura 3. Cómo guardar varias imágenes. dflinebreak &quot;&gt; Tratamiento de imágenes y análisis de la migración. <img alt="Figura 4a" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig4a.jpg" /> La figura 4a. Pasos para importar la imagen para el análisis de datos. <img alt="Figura 4b" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig4b.jpg" /> Figura 4b. Pasos para analizar los datos utilizando el protocolo de rastreo de partículas. <img alt = &quot;Figura 4c&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3585/3585fig4c.jpg&quot; /&gt; Figura 4C. Ventana que representa longitud de trayectoria de las partículas sometidas a seguimiento. Pasos de análisis de datos. <img alt="Figura 5a" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5a.jpg" /> Figura 5a. Pasos que representan los parámetros de protocolo de partícula de seguimiento. <img alt="Figura 5b" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5b.jpg" /> Figura 5b. Selección de las estadísticas de ruta a analizar. <img alt="La figura 5c" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5c.jpg" /> Figura 5c. Los pasos para crear la máscara para el protocolo de seguimiento automatizado. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig6.jpg" /> Figura 6. La velocidad media (Figura6a) y el desplazamiento (Figura 6b) se representa en una parcela de bigotes. La muestra de ensayo muestra un incremento de la velocidad y el desplazamiento como comparar a controlar. Cine Película 1. La migración de las células de control. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585movie1.avi" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película</a> . Película 2. La migración de las células de prueba. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585movie2.avi" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película</a> . Control de la MDA-MB-231 y la prueba de la MDA-MB-231 células fueron sembradas con baja densidad de colágeno para pasar la noche. Lapso de tiempo microscopía de vídeo se realizó mediante microscopio Olympus, acoplado a una cámara EM-Hamamatsu. Las imágenes son tomadas en un intervalo de una hora durante 18 horas durante la migración al azar. Por favor, vea las películas de la migración al azar para el control y prueba.

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	<li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+a+physically+integrated+molecular+process.">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84, 359-369 (1996).</li><li>Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+integrating+signals+from+front+to+back.">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302, 1704-1709 (2003).</li><li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+versus+directionally+persistent+cell+migration.">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).</li><li>Valone, F. H., Austen, K. F., Goetzl, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+random+migration+of+human+platelets.">Modulation of the random migration of human platelets.</a> J. Clin. Invest. 54, 1100-1106 (1974).</li><li>Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+speed+comparison+of+microscope+software+programs.">Acquisition speed comparison of microscope software programs.</a> Microsc. Res. Tech. 74, 539-545 (2011).</li><li>Struckhoff, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+ROCK+in+tumor+cells+controls+CXCR4-driven+adhesion+events.">Dynamic regulation of ROCK in tumor cells controls CXCR4-driven adhesion events.</a> J. Cell. Sci. 123, 401-412 (2010).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophoton. Internat. 11, 36-42 (2004).</li><li>Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Tyl Hewitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+collagen+and+fibronectin+in+neural+crest+cell+adhesion+and+migration.">Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration.</a> Dev. Biol. 87, 259-266 (1981).</li><li>Albini, A., Sporn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumour+microenvironment+as+a+target+for+chemoprevention.">The tumour microenvironment as a target for chemoprevention.</a> Nat. Rev. Cancer. 7, 139-147 (2007).</li><li>Yu, Y. P., Luo, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myopodin-mediated+suppression+of+prostate+cancer+cell+migration+involves+interaction+with+zyxin.">Myopodin-mediated suppression of prostate cancer cell migration involves interaction with zyxin.</a> Cancer. Res. 66, 7414-7419 (2006).</li><li>Teng, T. S., Lin, B., Manser, E., Ng, D. C., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat3+promotes+directional+cell+migration+by+regulating+Rac1+activity+via+its+activator+betaPIX.">Stat3 promotes directional cell migration by regulating Rac1 activity via its activator betaPIX.</a> J. Cell. Sci. 122, 4150-4159 (2009).</li><li>Wozniak, M. A., Kwong, L., Chodniewicz, D., Klemke, R. L., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-Ras+controls+membrane+protrusion+and+cell+migration+through+the+spatial+regulation+of+Rac+and+Rho.">R-Ras controls membrane protrusion and cell migration through the spatial regulation of Rac and Rho.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 84-96 (2005).</li><li>Orr, A. W., Elzie, C. A., Kucik, D. F., Murphy-Ullrich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondin+signaling+through+the+calreticulin/LDL+receptor-related+protein+co-complex+stimulates+random+and+directed+cell+migration.">Thrombospondin signaling through the calreticulin/LDL receptor-related protein co-complex stimulates random and directed cell migration.</a> J. Cell Sci. 116, 2917-2927 (2003).</li><li>Smith, A., Bracke, M., Leitinger, B., Porter, J. C., Hogg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LFA-1-induced+T+cell+migration+on+ICAM-1+involves+regulation+of+MLCK-mediated+attachment+and+ROCK-dependent+detachment.">LFA-1-induced T cell migration on ICAM-1 involves regulation of MLCK-mediated attachment and ROCK-dependent detachment.</a> J. Cell Sci. 116, 3123-3133 (2003).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

El ensayo de tiempo real la migración al azar permite precisa, el análisis sensible, de los parámetros de la migración de células tales como la velocidad y el desplazamiento. Este método no se limita a terminar valor del punto de medición, por lo que es más cuantitativo. Puesto que, las células se controlan en condiciones normales de medio DMEM con suero, reduce el efecto deletéreo de incubación más largo en medio libre de suero. Se ha demostrado que la migración de las células depende de el formato y romp...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gemini Bio-Productos </td><td> 100-106 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-Mem </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> El colágeno </td><td> BD </td><td> 354231 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio con cámara de células vivas y controlador automático XY </td><td> Olimpo </td><td> Olympus 1X81 </td><td></td></tr><tr><td> Cámara de control del medio ambiente </td><td> Neue </td><td> Neue Cámara en vivo de la célula </td><td> El nuestro tiene una costumbre construido sobre rectangular placa de vidrio para la óptica apropiados a través de la parte superior de la cámara. La forma rectangular tiene capacidad para múltiples placas utilizadas en muchos de nuestros experimentalts. </td></tr><tr><td> Automatizado de fase XY </td><td> Anterior </td><td> Antes Proscan </td><td> Esto permite retorno precisa para multiplicar seleccionados posiciones XY durante la microscopia lapso de tiempo. </td></tr><tr><td> Cámara </td><td></td><td> Hamamatsu EM cámara C9100 </td><td></td></tr><tr><td> Software </td><td> Normalmente, comprar a través de microscopio, como vendedor de Olympus </td><td> Deslice el Libro 5 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of random migration of cells using time-lapse video microscopy

La migración celular es un proceso dinámico, que es importante para el desarrollo embrionario, la reparación de tejidos, la función del sistema inmune, y la invasión tumoral de 1, 2. Durante la migración direccional, las células se mueven rápidamente en respuesta a una señal quimiotáctica extracelular, o en respuesta a las señales intrínsecas 3 proporcionados por la maquinaria motilidad de base. La migración al azar se produce cuando una célula posee direccionalidad intrínseca baja, permitiendo que las células de explorar su medio ambiente local. Migración celular es un proceso complejo, en la celda de la respuesta inicial se somete a la polarización y se extiende protuberancias en la dirección de migración 2. Los métodos tradicionales para medir la migración tal como el ensayo de migración de Boyden cámara es un método sencillo para medir la quimiotaxis in vitro, que permite medir la migración como un resultado punto final. Sin embargo, este enfoque no permite la medición de los parámetros individuales de migración, ni permite que Visualización de los cambios morfológicos que sufre durante la migración celular. A continuación, presentamos un método que nos permite monitorear la migración de células en tiempo real mediante video - microscopía de lapso de tiempo. Dado que la migración celular y la invasión son el sello distintivo del cáncer, este método será de aplicación en el estudio de la migración de las células cancerosas y la invasión in vitro. Migración aleatoria de las plaquetas se ha considerado como uno de los parámetros de la función plaquetaria 4, por lo tanto, este método también podría ser útil en el estudio de las funciones plaquetarias. Este ensayo tiene la ventaja de ser rápido, reproducible, fiable y no requiere la optimización del número de células. Con el fin de mantener las condiciones fisiológicamente adecuados para las células, el microscopio está equipado con CO 2 de suministro y el termostato de la temperatura. Movimiento de las células es controlado por la toma de fotografías con una cámara instalada en el microscopio, a intervalos regulares. Migración de la célula puede ser calculado por la medición de velocidad media y unael desplazamiento PROMEDIO, que se calcula por el software Slidebook.

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Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Este método permite la monitorización de las células en tiempo real y las mediciones cuantitativas de los diferentes parámetros de la migración, como la velocidad, el desplazamiento y la velocidad. A diferencia de los métodos tradicionales, este enfoque en tiempo real no se basa en las mediciones cuantitativas de migración de punto final, sino que permite el seguimiento y el cálculo de diferentes parámetros de forma continua.

Análisis cuantitativo de la migración desordenada de las células mediante microscopía de Time-lapse vídeo

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

quantitative-analysis-random-migration-cells-using-time-lapse-video

Research

JoVE Journal

Biology

16.7K vistas.  LSU School of Medicine. Este método permite la monitorización de las células en tiempo real y las mediciones cuantitativas de los diferentes parámetros de la migración, como la velocidad, el desplazamiento y la velocidad. A diferencia de los métodos tradicionales, este enfoque en tiempo real no se basa en las mediciones cuantitativas de migración de punto final, sino que permite el seguimiento y el cálculo de diferentes parámetros de forma continua.

Video: Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoreo de actina desmontaje con la Microscopía de Time-lapse

Investigación

Biología

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

El uso de microscopía lapso de tiempo para Visualizar anoxia inducida animación suspendida en<em&gt; C. elegans</em&gt; Los embriones

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Análisis cuantitativo de la autofagia mediante microscopía de fluorescencia avanzada 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualización de Desarrollo Craneofacial en los SOX10: Kaede pez cebra transgénico Línea Usando Time-lapse microscopía confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time points. Time intervals can be set through a computer interface that controls the microscope-integrated camera. This kind of microscopy requires both the ability to acquire very rapid events and the signal generated by the observed cellular structure during these events. After the images have been collected, a movie of the entire experiment is assembled to show the dynamic of the molecular events of interest. Time-lapse video microscopy has a broad range of applications in the biomedical research field and is a powerful and unique tool for following the dynamics of the cellular events in real time. Through this technique, we can assess cellular events such as migration, division, signal transduction, growth, and death. Moreover, using fluorescent molecular probes we are able to mark specific molecules, such as DNA, RNA or proteins and follow them through their molecular pathways and functions. Time-lapse video microscopy has multiple advantages, the major one being the ability to collect data at the single-cell level, that make it a unique technology for investigation in the field of cell biology. However, time-lapse video microscopy has limitations that can interfere with the acquisition of high quality images. Images can be compromised by both external factors; temperature fluctuations, vibrations, humidity and internal factors; pH, cell motility. Herein, we describe a protocol for the dynamic acquisition of a specific protein, Parkin, fused with the enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) in order to track the selective removal of damaged mitochondria, using a time-lapse video microscopy approach.

Herein, we describe in detail a time-lapse video microscopy approach to measuring the temporal recruitment of EYFP-Parkin during the selective removal of damaged mitochondria. This dynamic process of EYFP-Parkin-dependent removal of damaged mitochondria can be used as an indicator of cellular health under different experimental conditions.

Lapso de tiempo-microscopía de vídeo para la Evaluación de EYFP-Parkin agregación como un marcador para celular mitofagia

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

Lente libre Video microscopia para la dinámica y el análisis cuantitativo del cultivo de células adherentes

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Etiquetado específico de nucleoides mitocondriales para microscopía de iluminación estructurada de lapso de tiempo

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. Therefore, it is considered a living antibiotic. To apply B. bacteriovorus as a living antibiotic, it is first necessary to understand the major stages of its complex life cycle, particularly its proliferation inside prey. So far, it has been challenging to monitor successive stages of the predatory life cycle in real-time. Presented here is a comprehensive protocol for real-time imaging of the complete life cycle of B. bacteriovorus, especially during its growth inside the host. For this purpose, a system consisting of an agarose pad is used in combination with cell-imaging dishes, in which the predatory cells can move freely beneath the agarose pad while immobilized prey cells are able to form bdelloplasts. The application of a strain producing a fluorescently tagged &#946;-subunit of DNA polymerase III further allows chromosome replication to be monitored during the reproduction phase of the B. bacteriovorus life cycle.

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Presented here is a protocol that describes monitoring of the complete life cycle of predatory bacterium Bdellovibrio bacteriovorus using time-lapse fluorescence microscopy in combination with an agarose pad and cell-imaging dishes.

Imágenes de células vivas del ciclo de vida del depredador bacteriavo Bdellovibrio mediante microscopía de fluorescencia Time-Lapse

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. ...