Nos gustaría agradecer a Michael Feyder y Terrell Holloway por su ayuda durante la configuración inicial de la técnica y el laboratorio del doctor Fumi Ono s para el acceso a su microscopio confocal. Esta investigación fue financiada por el Instituto Nacional de Salud a través del programa intramuros del NIAAA y NINDS.

1. Preparación DII / tungsteno Balas bolas: DII (1-1&#39;-dioctadecil-3, 3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perclorato) balas deben estar preparados antes de cortar rodajas de cerebro. El procedimiento tarda aproximadamente 2-4 horas, dependiendo de cuántas balas se preparan a la vez. <ol><li> Si a partir de un nuevo lote de bolas de tungsteno, preparar alícuotas de 300 mg cada uno. Las alícuotas son preparados por la suspensión de 6 gramos de tungsteno en 2 ml de cloruro de metileno. Luego, pipeta de 100 l de solución de cordón en tubos de microcentrífuga para producir alícuotas de 300 mg de tungsteno cuentas alícuotas Conservar a temperatura ambiente (Nota: cloruro de metileno se evapora muy rápidamente el alcohol también se puede utilizar para minimizar la evaporación.)... </li><li> Cuando a partir de alícuotas de cuentas, resuspender cada alícuota (300 bolas de tungsteno mg) en 300 l de cloruro de metileno y cubrir rápidamente para evitar la evaporación. Esta cantidad es suficiente para 3 lotes de balas. </li><li> Prepare una solución de tinte pesando 13,5 mg de DII tinte lipofílica y la adición de 450 l de cloruro de metileno (concentración final = 3mg/100μl). </li><li> Escudo de la cuentas con el tinte. Coloque una placa de vidrio sobre un pedazo de cera recubierta de papel y un peso Pipetear 100 L de cuentas en la diapositiva. Añadir 100 ml de la solución de DII, mezclar bien con punta de la pipeta, y secar al aire hasta que gotas a su vez de color gris claro. </li><li> Use una hoja de afeitar para raspar cuentas de la lámina de vidrio y los dados de las cuentas en un polvo fino (Nota: utilice un disco nuevo, si hace más de un color de balas a fin de no contaminar los colorantes).. </li><li> Cuentas de raspar en el pesaje cuentas de papel y el embudo en un tubo cónico de 15 ml. Añadir 3 ml de agua y de ultrasonidos en baño de agua durante 10-30 minutos a temperatura ambiente (Nota: dados de polvo y ultrasonidos se aplican para reducir al mínimo la formación de grupos de bolas recubiertas que interrumpir el etiquetado escaso de neuronas individuales).. </li></ol> 2. Preparación de polivinilpirrolidona (PVP) y el tubo de la solución: Para mejorar el agarre del talón a la tubería de bala (tubos TEZFEL), cubrir con polivinilpirrolidona (PVP) solución. <ol><li> Prepare 10 ml de solución de PVP en agua a una concentración de 10 mg de PVP / ml. </li><li> Use una jeringa de 12 ml con adaptador de tubos (tubo flexible con un diámetro ligeramente más grande) para pasar la solución de PVP a través del tubo de bala y luego lo expulsan por el otro extremo. Reutilización de la solución a un tubo de más abrigo bala si varios lotes se preparan de forma simultánea. Desechar la solución PVP después de su uso. </li><li> Para agregar las cuentas de la tubería de bala, vórtice de las cuentas para producir una solución homogénea y el uso de la jeringa para extraer la solución de cuentas a través de la tubería para que las cuentas se distribuyen uniformemente a lo largo de la tubería. ((Nota:) tratar de minimizar el número de burbujas de aire en la tubería). </li><li> Colocando la manguera a través de la estación de la preparación y permitir que las cuentas que saldar. Use la jeringa para extraer con cuidado el agua de manera que sólo las cuentas siguen siendo. </li><li> Girar el tubo en la estación de la preparación y seco con gas de nitrógeno hasta que las gotas de agua ya no son visibles. Este paso dura aproximadamente 10-20 minutos. </li><li> Cortar las balas con cortador de tubo en 13 mm de longitud y el lugar en viales de centelleo que contienen Drierite o algún tipo de sulfato de calcio anhidro. Envuelva en papel de viales para protegerlo de la luz. </li></ol> 3. La tinción DII: Esta técnica se puede utilizar el etiquetado para teñir las neuronas en el tejido cerebral de diversas especies, en este caso particular, de ratón (3-6 meses de edad) y los primates no humanos (9-15 años). Es preferible que los cortes son preparados a partir de tejido cerebral de perfusión fijo obtenido por transcardiaca de solución fijadora por la preservación del tejido que se espera ser el mejor en esta situación. Sin embargo, la fijación por perfusión no siempre es posible (como fue el caso de los tejidos de mono) y el etiquetado DiOLISTIC todavía puede ser aplicado con éxito en diferentes procedimientos para la preparación del tejido. Aquí se describen tres procedimientos diferentes para la preparación del tejido: <ol class="lalpha"><li> Fix cerebral de perfusión cerebral transcardiaca → → eliminar postfix durante 10 minutos → → rebanada cortada mancha </li><li> Quitar el cerebro → bloque de corte de tejido → → bloque fijar en el segmento de lavado PBS corte → → mancha </li><li> Quitar el cerebro → → rebanadas cortadas fijar → → lavar la mancha </li></ol> En el presente estudio, los cerebros de los monos se obtuvieron de los sujetos que fueron perfundidos con helada transcardially artificial líquido cefalorraquídeo (ACSF) antes de la cosecha del cerebro y un bloque (4 mm de espesor) de tejido que contiene el núcleo caudado unaª putamen se fijó durante 60 minutos a temperatura ambiente. Para todos los procedimientos, solución fijadora contiene paraformaldehído al 4% y 4% de sacarosa en PBS (preparados frescos o utilizarse dentro de 15 días). Es importante tener en cuenta que los tiempos de fijación son críticas para la tinción de éxito. Overfixation puede afectar a la tinción mediante la interrupción de la integridad de la membrana plasmática y causando tinte se salga de la celda (ver más información en los resultados). <ol><li> Para el procedimiento A y B, rebanadas (200μm) se cortan de cerebro fijo o bloque de tejido y las rodajas de colocar en 24 y la placa con PBS. Para el procedimiento de c, frescas rebanadas cerebral agudo (200 m) se cortan con un vibratome en una solución de corte en frío que contiene (en mM) 110 de colina-Cl, 25 de NaHCO3, 1,25 NaH 2 PO 4, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 7 de MgCl 2, 25 glucosa, ácido ascórbico, 11,6, 3,1 ácido pirúvico (osmolaridad = 310 mOsmols) e inmediatamente después de las rebanadas se colocan en placas de 24 pocillos y se fija durante 30 minutos con solución fijadora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las rodajas con PBS, 3 veces. </li><li> Antes de rebanadas de rodaje, retire la PBS a partir de los pozos y, con un pincel, coloque la rebanada en el centro del pozo. </li><li> Dispara balas de DII a través de 3,0 micras de papel de filtro utilizando un sistema de Gene Helios pistola a 120-180 psi de presión de gas de helio, colocando la pistola a una distancia de 1,5 cm entre la muestra y el extremo del cañón. (Nota importante:. Neuronas sólo dentro de los 50 mm de la superficie de corte será etiquetado por este método, por lo que es importante mantener el mismo lado de la corte hacia arriba durante el lavado y para el montaje De esta manera, usted se asegurará de que el neuronas marcadas estará dentro de la distancia focal cuando se generan imágenes con un microscopio confocal). </li><li> Lávese las rebanadas con PBS 3 veces y almacenarlos en PBS durante varias horas para permitir que el DII para difundir a lo largo de las dendritas. </li><li> Monte rodajas sobre un portaobjetos de vidrio con prolongar Antifade oro y cubrir con un 18x18 mm N º 1 cubreobjetos. (Nota: Para el Procedimiento C, lo mejor es montar las rebanadas en el mismo día de la integridad de los cortes no se mantiene bien durante la noche). </li><li> Sellar con esmalte de uñas transparente después de que medios de montaje se ha secado. </li><li> Por otra parte, los cortes se pueden teñir con anticuerpos antes de montar como se describe a continuación. (Nota: Las diapositivas se pueden utilizar por lo menos 6 meses a un año si se almacena en la oscuridad a 4 ° C. DII es sensible a la luz la exposición a largo plazo a la luz hará que la mancha se descolora). </li></ol> 4. La tinción de anticuerpos: La inmunotinción se debe realizar después del paso 3.4 y antes de montar. <ol><li> Permeabilización: rodajas de incubación en 0,01% Triton X-100 en solución de PBS por 15 min a temperatura ambiente (300-500 l por pocillo). NOTA: No utilizar concentraciones más altas de detergente, ya que se disuelven DII y reducir significativamente la tinción fluorescente. Trate de minimizar el tiempo de detergente incubaciones amplia también reducirá el etiquetado DII. Si incubación prolongado es necesario, mantener cortes en PBS en lugar de en solución de bloqueo. </li><li> Bloqueo: Incubar las rebanadas en la solución de bloqueo con 10% suero de cabra, el 0,01% de Triton X-100 en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Anticuerpo primario: Añadir anticuerpo a la dilución deseada en solución de bloqueo (por ejemplo, de conejo anti-GFP de anticuerpos en la dilución 1:1000). Añadir 300-500 l por pocillo e incubar durante 1-2 horas. (Nota: si incubaciones durante la noche es necesario, eliminar el detergente de la solución de bloqueo). </li><li> Lávese las rebanadas con PBS durante 5 a 15 minutos, 3 veces. </li><li> Anticuerpo secundario: Se incuba con el anticuerpo secundario durante 30 minutos a temperatura ambiente. Prepare una solución de anticuerpo secundario a la dilución deseada en solución de bloqueo (por ejemplo, Alexa-Fluor 488 anticuerpo conjugado en la dilución 1:1000). </li><li> Lávese las rebanadas con PBS durante 5-15 minutos, 4 veces. </li><li> Monte rebanadas de diapositivas con prolongar Antifade oro y cubrir con un 18x18 mm N º 1 cubreobjetos. Sellado con laca de uñas después de que medios de montaje se ha secado. </li></ol> 5. Los resultados representativos: <ol><li> Comprobación de la adecuación del etiquetado: la sección se puede visualizar en un ámbito fluorescentes disección equipado con una lámpara de mercurio y rojo cubo fluorescente filtro para confirmar el etiquetado DiOLISTIC éxito. La figura 1 muestra las imágenes ejemplares de las secciones del cerebro bien etiquetados obtenido a bajo aumento. Dos características importantes a tener en cuenta son un modelo de etiquetado escasa (fig. 1A) y la capacidad de identificar los distintos componentes celulares (Figura 1B-C). </li&gt; <li> Solución de problemas de etiquetado DiOLISTIC: La figura 2 muestra ejemplos de las secciones en las que el etiquetado DiOLISTIC trabajado de forma incorrecta. En nuestra experiencia, hay tres causas principales para el etiquetado ineficiente: <ul><li> El etiquetado es demasiado escasa o densa: muy pocas células son etiquetados por sección, en un caso o muchas células se denominan prevenir el aislamiento y estudio de los elementos celulares individuales. Solución: ajustar la concentración de bolas recubiertas en la solución final que se utiliza para el recubrimiento de la tubería de bala TEFZEL (sección 1.6). Aumentar o disminuir el volumen de agua (3 ml valor inicial) se utiliza para disolver las cuentas a fin de corregir el etiquetado demasiado escasa o demasiado densa, respectivamente. Además, la baja eficiencia de etiquetado puede ser causada por menos de presión de gas óptima al disparar las bolas recubiertas en las secciones. Esta posibilidad se puede descartar, asegurándose de que el tubo de bala TEFZEL ha publicado la mayoría de las perlas recubiertas y parece claro después del disparo. De lo contrario, la presión del gas de tiro debe ser mayor. </li><li> Balas mal: los grupos grandes o grupos de bolas de tungsteno recubiertas de tinte se forman durante la preparación de bala. Secciones se asemejan a los ejemplos en la Figura 2-B. Solución: hacer nuevas balas prestando especial atención a la sección 1.5 y / o extender el tiempo de tratamiento con ultrasonidos en la sección 1.6. </li><li> Más de fijación: el tejido se mantiene en solución de paraformaldehído durante más tiempo que el tiempo óptimo necesario para la fijación (30 minutos de 200-300 micras secciones, 1 hora por 4 secciones mm). Esto compromete la integridad de la membrana plasmática y produce secciones etiquetadas que se parecen a los que se muestran en la Figura 2C-D en el que el etiquetado parece fuera de foco debido a la dispersión de colorante de las células. Solución: reducir el tiempo de fijación. </li></ul></li><li> Imagen confocal: pilas de imágenes son adquiridas mediante un microscopio confocal (Zeiss LSM 510 META), con un objetivo 20x para toda la celda y el objetivo 63x de inmersión en agua para los segmentos de las dendritas. DII se emocionó con una línea de DPS 561 nm láser y la fluorescencia verde de la secundaria de anticuerpos se emocionó con una línea de 488 nm láser. El seccionamiento óptico de la muestra de la etiqueta logra cuando mediante microscopía confocal permite, además, para el aislamiento de una sola células marcadas en la muestra. La figura 3A muestra una neurona espinosa mediana estriado del cerebro de ratón y su patrón complejo dendrita rama. Imágenes de gran aumento de dendritas de las neuronas de los roedores (Figura 3B) y primates no humanos (Figura 3C) demuestran el grado de tinción de dendritas y espinas dendríticas uso de esta técnica en ambas especies. Dendritas y sus protuberancias (espinas) aparecen bien definidos, incluso cuando se consideran la columna vertebral larga y delgada cabezas tan abundante en neuronas espinosas. Cuando se combinan con DiOLISTICS inmunotinción, imagen confocal también es útil para localizar de manera inequívoca que la mancha en el mismo plano focal y la misma celda. La Figura 4 muestra un ejemplo de la colocalización de DII etiquetado y la inmunotinción de las buenas prácticas agrarias en una sola célula. La imagen es una pila (0,7 m z-sección) obtenidos a partir de una porción del estriado de un ratón transgénico que expresa la proteína fluorescente GFP bajo el promotor del receptor de dopamina D1. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. DII etiquetado de las neuronas en secciones de cerebro de los primates no humanos. (A) Imagen bajo aumento de una porción del cerebro manchado que contiene el núcleo caudado de un mono cynomolgus etiquetado que muestra escasa de neuronas con DII. (BC) Alejado neuronas espinosas pueden ser fácilmente identificados con un alcance fluorescentes de disección. <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Etiquetado DiOLISTIC solución de problemas. (AB) rebanadas manchado de cuerpo estriado dorsal de monos (A) y el ratón (B) muestra los grupos grandes de colorante revestida de piedras y, en consecuencia, no hay elementos celulares individuales se pueden distinguir. (CD) Las imágenes que ilustran el resultado de aplicar DiOLISTIC etiquetado de las secciones que se mantuvieron en solución fijadora durante períodos prolongados de tiempo, o cuando la conservación de tejidos no en mono (C) y tejidos de ratón (D). <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Imagen confocal de neuronas espinosas del estriado medio manchadas de DII. (A), la pila de la imagen de una célula completa permite el análisis morfológico de las ramas dendríticas. (BC) Dendrite segmentos de ratón (B) y el mono (C) neuronas espinosas mostrar un etiquetado claro de las dendritas y espinas. <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. La combinación de etiquetado DiOLISTIC con inmunotinción. (A) DII etiquetado <strong&gt; medio de las neuronas espinosas del cuerpo estriado de las buenas prácticas agrarias BAC ratones transgénicos que expresan bajo el promotor del receptor de dopamina D1 (B). inmunotinción con anticuerpos anti-GFP como se describe en los métodos de adaptación de Lee et al. (2006). Mismo ámbito de la A. (C) Imagen compuesta de rojo y de fluorescencia de color verde identifica DII-etiquetados neurona como una neurona GFP-positivas.

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOLISTIC"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOLISTIC" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harb Protoc. , pdb.prot5202-pdb.prot5202 (2009).</li><li>Grutzendler, J., Tsai, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+labeling+of+neuronal+populations+by+ballistic+delivery+of+fluorescent+dyes.">Rapid labeling of neuronal populations by ballistic delivery of fluorescent dyes.</a> Methods. 30, 79-85 (2003).</li><li>Lee, K. W., Kim, Y., Kim, A. M., Helmin, K., Nairn, A. C., Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine-induced+dendritic+spine+formation+in+D1+and+D2+dopamine+receptor-containing+medium+spiny+neurons+in+nucleus+accumbens.">Cocaine-induced dendritic spine formation in D1 and D2 dopamine receptor-containing medium spiny neurons in nucleus accumbens.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 3399-3404 (2006).</li><li>Matsubayashi, Y., Iwai, L., Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+double-labeling+with+carbocyanine+neuronal+tracing+and+immunohistochemistry+using+a+cholesterol-specific+detergent+digitonin.">Fluorescent double-labeling with carbocyanine neuronal tracing and immunohistochemistry using a cholesterol-specific detergent digitonin.</a> J Neurosci Methods. 174, 71-81 (2008).</li><li>Neely, S. t. a. n. w. o. o. d., Deutch, G. D., Y, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+diOlistic+labeling+with+retrograde+tract+tracing+and+immunohistochemistry.">Combination of diOlistic labeling with retrograde tract tracing and immunohistochemistry.</a> J Neurosci Methods. 184, 332-336 (2009).</li><li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diolistics:+incorporating+fluorescent+dyes+into+biological+samples+using+a+gene+gun.">Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun.</a> Trends Biotechnol. 25, 530-534 (2007).</li><li>Shen, H. W., Toda, S., Moussawi, K., Bouknight, A., Zahm, D. S., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+dendritic+spine+plasticity+in+cocaine-+withdrawn+rats.">Altered dendritic spine plasticity in cocaine- withdrawn rats.</a> J. Neurosci. 29, 2876-2884 (2009).</li></ol>

Todos los procedimientos con animales se realizaron siguiendo las orientaciones de la Protección de los Animales y el empleo en el NIAAA y el Centro Nacional de Oregon Primate Research. Los autores no tienen nada que revelar.

Etiquetado DiOLISTIC es una de las técnicas más versátiles disponibles para las células con fluorescencia de etiquetado, ya que se pueden aplicar a las secciones de tejidos de diversas especies, a un amplio rango de edades, y en el tejido obtenido fresco o de fijador-perfusión animales (véase también Gan et al ., 2009). El proceso es relativamente rápido, ya que toma de 1-2 días y puede ser combinado con otros métodos de etiquetado más clásicos, como la inmunotinción (Lee et al., 2006). Se debe prestar especial atención a evitar el exceso de fijación y el uso de las concentraciones de detergente de alta en soluciones de incubación ya que estos se componen de la integridad de la membrana lipofílica y hacer que el tinte se salga de las células. La penetración de anticuerpos puede ser facilitado por las bajas concentraciones de Triton X-100 (Lee et al., 2006), así como digitonina o saponina en la solución de incubación (Matsubayashi et al., 2008). Algunas de las modificaciones que se pueden aplicar a esta técnica incluyen el uso de balas con tintes múltiples según lo descrito por Gan et al. (2000) o el cambio de la longitud y el tipo de exposición de anticuerpos (Neely et al., 2009). Tradicionalmente, el DII ha sido utilizado para trazar proyecciones neuronales en el cerebro. Etiquetado DiOLISTIC amplía su aplicación mediante la descripción de un método útil para examinar la morfología celular. Morfología neuronal es de gran interés debido a la gran diversidad encontrada en el cerebro y la especulación de que la forma celular sea incompatible con la función de la multiplicidad de las poblaciones neuronales en el sistema nervioso. Un ejemplo de ello es el hecho de que muchas neuronas en los mamíferos protrusión pantalla del sistema nervioso pequeñas llamadas espinas dendríticas que son el sitio de las sinapsis glutamatérgicas. De esta forma, la densidad de las sinapsis glutamatérgicas en una célula puede ser correlacionada con la densidad de las espinas dendríticas, que puede ser medido con la técnica de etiquetado descritos en este documento. Además, otros parámetros morfológicos como la longitud dendrítica total, patrón de ramificación, forma la espina dendrítica y la densidad se puede cuantificar y estudiar. El uso de marcaje fluorescente para el estudio de la morfología neuronal tiene muchas ventajas en comparación con las técnicas más tradicionales que se basan en microscopía de campo claro (por ejemplo, la tinción de Golgi), ya que permite obtener imágenes de mayor resolución confocal. Otra ventaja de usar DII como un fluoróforo en experimentos destinados a medir la densidad y la morfología de la espina dendrítica es sus propiedades lipofílicas. Particiones DII en la membrana plasmática y proporciona un esquema bien definido de los procesos neuronales y protuberancias dendríticas. Dado el pequeño volumen de la mayoría de las espinas dendríticas (menos de 1 femtoliter), la tinción de la membrana es más eficiente y permite una mejor visualización de protuberancias pequeñas y delgadas que la tinción citoplasmática.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1-1&#x2019;-dioctadecyl-3,3,3&#x2019;,3&#x2019;- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methylene chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
<td>H485-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tungsten beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2269</td>
<td>1.7 &mu;m diameter</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyvinylpyrrolidone </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>529504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tefzel bullet tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2441</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing cutter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2422</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios Gene Gun</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2431</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopore membrane filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>TSTP02500</td>
<td>3.0 &mu;m pore size</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold Antifade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>30525-89-4</td>
<td>(16% w/v)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

diolistic labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices

Tinción DiOLISTIC utiliza la pistola de genes para introducir tintes fluorescentes, como DII, en las neuronas de las secciones de cerebro (Gan et al, 2009;. O&#39;Brien y Lummis, 2007; Gan et al, 2000).. A continuación presentamos una descripción detallada de cada paso necesario, junto con imágenes de ejemplares de los resultados de bueno y lo malo que le ayudará a la hora de establecer la técnica. En nuestra experiencia, a pocos pasos resultó fundamental para la aplicación exitosa de DiOLISTICS. Estos aspectos incluyen la calidad de las balas DII-revestidos, el grado de exposición de fijación, y la concentración de detergente que se usa en las soluciones de incubación. Consejos y soluciones para los problemas comunes se proporcionan. Esta es una técnica de etiquetado versátil que se puede aplicar a múltiples especies de animales en un amplio rango de edades. A diferencia de otras técnicas de marcaje fluorescente que se limitan a la preparación de los animales jóvenes o se limita a los ratones porque se basan en la expresión de un transgén fluorescentes, etiquetado DiOLISTIC se puede aplicar a los animales de todas las edades, especies y genotipos, y puede ser utilizado en combinación con tinción para identificar una subpoblación de células específicas. Aquí se demuestra el uso de DiOLISTICS marcar las neuronas en secciones de cerebro de ratones adultos y adultos primates no humanos con el fin de cuantificar las dendritas de ramificación y la morfología de la espina dendrítica.

Watch this Scientific Journal Video about DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices at JoVE.com

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Se demuestra el uso de la pistola de genes para introducir tintes fluorescentes, como DII, en las neuronas en secciones de cerebro de los roedores y primates no humanos de diferentes edades. En este caso particular, utilizamos ratones adultos (3-6 meses de edad) y adultos de los monos cynomologus (9-15 años). Esta técnica, descrita originalmente por el laboratorio del Dr. Lichtman (Gan<em&gt; Et al</em&gt;., 2000), es muy adecuado para el estudio de las ramificaciones dendríticas y la morfología de la espina dendrítica y puede ser combinado con tinción tradicionales, si los detergentes se mantienen a una concentración baja.

Etiquetado DiOLISTIC de las neuronas de los roedores y no humanos rodajas de cerebro de los primates

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

diolistic-labeling-neurons-from-rodent-non-human-primate-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.8K vistas.  NIH. Se demuestra el uso de la pistola de genes para introducir tintes fluorescentes, como DII, en las neuronas en secciones de cerebro de los roedores y primates no humanos de diferentes edades. En este caso particular, utilizamos ratones adultos (3-6 meses de edad) y adultos de los monos cynomologus (9-15 años). Esta técnica, descrita originalmente por el laboratorio del Dr. Lichtman (Gan Et al., 2000), es muy adecuado para el estudio de las ramificaciones d...

Video: DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation de las neuronas del cerebro de roedores Rodajas para el Estudio de la transmisión sináptica y la imagen terminales presinápticos

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Investigación

Neurociencias

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Sensibles al voltaje Dye grabación de axones, dendritas y espinas dendríticas de las neuronas individuales en rodajas de cerebro

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

Cultivo de células madre neurales de Regiones convencionales y no convencionales del cerebro adulto de roedores

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparación de tejido cerebral de primates no humanos para Pre-incrustación de inmunohistoquímica y la microscopía electrónica de

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

Aplicación de la abrazadera de parche guiada por imágenes automatizada para el estudio de neuronas en cortes cerebrales

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

Evaluación de la densidad de sinapsis en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Aislamiento y extracción de ARN de las neuronas, macrófagos y Microglia de cerebros de larvas de pez cebra

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) is a promising approach when pharmacological treatment fails or neurosurgery is not recommended. Acute brain slices coupled to microelectrode arrays (MEAs) represent a valuable tool to study neuronal network interactions and their modulation by electrical stimulation. As compared to conventional extracellular recording techniques, they provide the added advantages of a greater number of observation points and a known inter-electrode distance, which allow studying the propagation path and speed of electrophysiological signals. However, tissue oxygenation may be greatly impaired during MEA recording, requiring a high perfusion rate, which comes at the cost of decreased signal-to-noise ratio and higher oscillations in the experimental temperature. Electrical stimulation further stresses the brain tissue, making it difficult to pursue prolonged recording/stimulation epochs. Moreover, electrical modulation of brain slice activity needs to target specific structures/pathways within the brain slice, requiring that electrode mapping be easily and quickly performed live during the experiment. Here, we illustrate how to perform the recording and electrical modulation of 4-aminopyridine (4AP)-induced epileptiform activity in rodent brain slices using planar MEAs. We show that the brain tissue obtained from mice outperforms rat brain tissue and is thus better suited for MEA experiments. This protocol guarantees the generation and maintenance of a stable epileptiform pattern that faithfully reproduces the electrophysiological features observed with conventional field potential recording, persists for several hours, and outlasts sustained electrical stimulation for prolonged epochs. Tissue viability throughout the experiment is achieved thanks to the use of a small-volume custom recording chamber allowing for laminar flow and quick solution exchange even at low (1 mL/min) perfusion rates. Quick MEA mapping for real-time monitoring and selection of stimulating electrodes is performed by a custom graphic user interface (GUI).

We illustrate how to perform recording and electrical modulation of 4-aminopyridine-induced epileptiform activity in rodent brain slices using microelectrode arrays. A custom recording chamber maintains tissue viability throughout prolonged experimental sessions. Live electrode mapping and selection of stimulating pairs are performed by a custom graphical user interface.

Grabación y modulación de la actividad epileptiforme en rebanadas de cerebro de roedor juntada a arreglos de microelectrodos

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...