Los autores desean agradecer al Dr. Alistair Garratt (Centro Max Delbrück, en Berlín) por sus valiosos comentarios. Este trabajo fue apoyado por el centro de investigación en colaboración (SFB665) del Consejo Alemán de Investigaciones (DFG).

1. Disección de procedimiento Nota: El uso experimental de ratones deben seguir las directrices aprobadas oficialmente por el cuidado y uso de animales de laboratorio. <ol><li> Antes de preparar, configurar el microscopio de disección y diseñar los instrumentos quirúrgicos necesarios para la disección como tijeras grandes y pequeñas, grandes pinzas dentadas, pinzas curvas y cuatro juegos de Dumont N º 5 Pinzas de disección (dos de los cuales en el interior pulido consejos) ( para más detalles ver la tabla de reactivos y equipos específicos). Coloque una hoja de papel de filtro en una de 100 mm con recubrimiento Sylgard placa de Petri. Vierta PBS frío en los pocillos de una placa de 12 pocillos, un plato de Petri de 100 mm y un tubo de 12 ml y dejar en el hielo. Pipetear 2 ml de solución tampón de fijación (4% de paraformaldehído en PBS, pH 7,4) en cada pocillo de un segundo de 12 y placa y el lugar en el hielo. </li><li> Después de anestesia, el sacrificio de la presa embarazada a tiempo E12.5 (detección de tapón vaginal fue designado como E0.5), coloque el ratóncon su lado ventral hasta en tres hojas de papel de cocina y disfrutar de la zona abdominal con etanol al 70%. </li><li> Abrir la cavidad abdominopélvica, aislar a los cuernos uterinos bilaterales y transferirlos a uno de los platos de 100 mm con helado de PBS. </li><li> Bajo control microscópico, hacer una incisión longitudinal de la pared del útero con una tijera pequeña, recta y corte cada saco amniótico de la placenta. </li><li> Retire la bolsa de líquido amniótico de cada embrión y cortar el cordón umbilical. </li><li> Utilizando unas tijeras pequeñas, decapitar a los embriones y poner la cabeza o una parte de ellos a un lado para el aislamiento de ADN genómico, si genotipado se debe exigir. Posteriormente, la transferencia de la quirú a los respectivos pozos de la placa de 12 pocillos con PBS frío. </li><li> Moje el papel de filtro en el plato Sylgard con unas gotas de PBS y la posición de un tronco embrionarias, con su cara dorsal hasta en el papel. Para una mejor estabilidad, enderezar la cola y las extremidades del cuerpo. </li><li> De trabajoen un microscopio con un aumento de aproximadamente 16x, cuidadosamente pellizcar la piel del embrión por encima de la médula espinal, con dos pares de pinzas de punta fina y suavemente lo desgarran. A partir de la media, proceder en primer lugar hacia la cola y luego reanudar la actividad desde el centro hacia el lado anterior. </li><li> Mojar el embrión de vez en cuando con dos o tres gotas de PBS para evitar que se seque. </li><li> Para evitar que DRG se llenaron de lágrimas de la médula espinal cuando es removido del embrión separar el DRG y la médula espinal de los alrededores de la columna vertebral cartilaginosa por movimientos de deslizamiento horizontal con la hoja de una pinza fina con el interior pulido consejos. A partir de la mitad del lado derecho del embrión, su forma de trabajo hacia la cola y luego a la parte anterior. A continuación, repita el procedimiento en el otro lado. Tenga cuidado de no arrancar la DRG asociados. </li><li> Para desconectar por completo el cable aflojado la columna vertebral del embrión, recoger sus cervical participar con unas pinzas finas y tire de ella en una sola pieza hacia su extremo caudal. </li><li> Sumerja el cable aislado espinal con DRG adjunto en un pocillo de la placa de 12 pocillos llenos de tampón de fijación y proceder con la preparación de la médula espinal de los embriones sobrantes. </li><li> Fijar la médula espinal por lo menos dos horas en hielo. </li></ol> 2. DII-etiquetado de las neuronas DRG <ol><li> Para cada una de la médula espinal que ser etiquetados, preparar dos agujas de cristal con un extractor de micropipeta. Utilizamos un modelo de Sutter P-97 electrodo extractor (ajuste del programa: 1 CALOR = 625, = 35 VEL, TIEMPO = 175, 2 CALOR = 600, = 25 VEL, TIEMPO = 175, 3 CALOR = 630, = VEL... 30, TIEMPO = 150). </li><li> Bajo control microscópico que moje la punta de la aguja de vidrio cada tres a cinco veces en un 5% (w / v) de DII en etanol. La evaporación del etanol crea una fina capa de cristales de DII en la aguja. </li><li> Trabajo en un microscopio con un aumento de aproximadamente 40x, un lugar de la médula espinal con sus ventral lado hasta en una diapositiva. El uso de tijeras de primavera, abra el cable en la parte ventral en toda su longitud, cortando a través de la placa del piso para permitir el posterior montaje de la preparación de un libro abierto invertido modo (véase la sección C). </li><li> Posición de la médula espinal con la cara dorsal hasta en una diapositiva. Luego manualmente el enfoque de la cuerda con la punta de la DII-cubierta de la aguja de vidrio bajo visualización microscópica y cuidadosamente perforar cada DRG segundo en un lado de la médula espinal. Casi no hay rastros de DII debe ser visible en el DRG perforado para asegurar el etiquetado de sólo un pequeño número de neuronas. Tomar una segunda aguja para el otro lado de la cuerda. Con el objetivo sólo uno de cada GRD segundo evita la superposición de la etiqueta proyecciones axonales de DRG vecinos que puedan complicar la diferenciación de los axones individuales. </li><li> Volver a la médula espinal en el búfer de fijación y se incuban en la oscuridad durante al menos seis horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C para dar tiempo a que el tinte se diffuse lo largo del axón en la membrana plasmática. Permitir un período de incubación más largo (hasta dos días a 4 ° C) si el análisis del crecimiento de las garantías en la médula espinal que se desea. </li></ol> 3. Análisis microscópico de montaje y <ol><li> A raíz de la difusión del colorante posición, un solo cordón espinal con la cara dorsal hacia abajo en un cubreobjetos en una gota de PBS. Tenga cuidado de que el DRG adjunto estén orientados lateralmente y no se mezclan. Aspirar el exceso de líquido y aplanar el cable en un libro abierto invertido el modo de uso de fórceps. </li><li> Monte la preparación en un portaobjetos con PBS. </li><li> Para evitar el aumento de la tinción de fondo no deseados análisis de fluorescencia microscópica de la etiqueta proyecciones axonales debe llevarse a cabo el día de montaje. Hasta entonces, mantener las diapositivas de la oscuridad a 4 ° C. </li></ol> 4. Los resultados representativos: La médula espinal del ratón recibe aferentes projections de 8 pares de cuello de útero, 13 pares de tórax, 5 pares de pares lumbares y 4 de la DRG sacra un total de 60 ganglios espinales. Después de algún entrenamiento la médula espinal con la mayoría de DRG todavía unido puede ser aisladas de un embrión de menos de cinco minutos. Este procedimiento es adecuado para el aislamiento de la médula espinal con el DRG adjunto de E11.5 E13.5 de embriones de ratón. Sin embargo, mejores resultados se obtienen a partir de E12.5. Resultados ejemplares del procedimiento de etiquetado descritos aquí se muestran en la Figura 3. El etiquetado de los GRD en toda la longitud de la médula espinal puede entonces ser utilizada para cuantificar el comportamiento de ramificación axonal en los diferentes niveles vertebrales (Fig. 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema que representa los dos principales modos de ramificación axonal. (A) La ramificación de las actividades del cono de crecimiento que podría conducir a una bifurcación - como se indica aquí - así como pérgolas complejo de la terminal o(B) la formación de colaterales en el eje del axón (ramificación intersticial). Este último modo es el tipo dominante de ramificación de la proyección de los axones corticales y tálamo-corticales 6,7. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig2.jpg" /> Figura 2 proyecciones aferentes de las neuronas DRG en la médula espinal de embriones de visualización de ambos tipos de ramificación axonal:. Poder axones por primera vez en la DREZ por la bifurcación (1) y de la hija resultante ramas colaterales forma después de un período de espera por la ramificación intersticial (2). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig3.jpg" /> Figura 3. Visualización de trayectorias individuales axonal de las neuronas embrionarias del ratón DRG. (A) de la médula espinal con el DRG adjunto, preparado a partir de un embrión de ratón E12.5. (Barra de escala, de 1 mm.) (BD) vista dorsal del DII-etiquetados DRG de ratones de tipo salvaje con un aumento cada vez se muestran. En B cada DRG segundo labeled de DII. Imágenes de fluorescencia se invierten, caudal está a la izquierda y en el C y D, es lateral en la parte inferior. En C un pequeño número de axones se etiqueta y en un mayor aumento de la presencia de T-como las ramas se pueden identificar en el DREZ de la médula espinal. (Las barras de escala, a 250 micras (B), 100 m (C) y 50 micras (D).) <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig4.jpg" /> Figura 4. Cuantificación de las ramas en forma de T, solo se convierte rostral o caudal en la naturaleza y tipo C-péptido natriurético tipo (CNP) de ratones deficientes en E13.5. El número de axones individuales se cuentan entre paréntesis para los niveles de tronco diferentes para cada genotipo. C o R gira - el crecimiento sólo en dirección caudal o rostral, respectivamente. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig5.jpg" /> Figura 5. A GMPc señalización activa bifurcación axón sensorial en el DREZ de la médula espinal. (A) Plan dela vía de señalización de cGMP formado por los CNP ligando, el receptor de guanilato ciclasa Npr2 y la serina / treonina kinasa cGKIα en las neuronas DRG embrionarias. Npr2 genera cGMP de GTP a la estimulación por el CNP. (B) DII seguimiento de los axones de las neuronas DRG solo en ratones de tipo salvaje y CNP deficiente. (Barra de escala, de 25 micras).

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	<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).</li><li>Acebes, A., Ferrus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+features+of+axon+collaterals+and+dendrites.">Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites.</a> Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).</li><li>Ozaki, S., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+trajectories+of+sensory+axons+toward+laminar+targets+in+the+developing+mouse+spinal+cord.">Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord.</a> J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+guanylyl+cyclase+Npr2+is+essential+for+sensory+axon+bifurcation+within+the+spinal+cord.">The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord.</a> J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).</li><li>Gibson, D. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+imaging+and+ultrastructural+analysis+of+individual+axon+terminals+labeled+by+iontophoretic+application+of+lipophilic+dye.">Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye.</a> J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+natriuretic+peptide+(CNP)+is+a+bifurcation+factor+for+sensory+neurons.">C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).</li><li>Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulate+axon+branching+by+the+cyclic+GMP+pathway+via+inhibition+of+glycogen+synthase+kinase+3+in+dorsal+root+ganglion+sensory+neurons.">Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).</li><li>Zhao, Z., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axonal+development+by+natriuretic+peptide+hormones.">Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).</li><li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+regulating+axonal+branching+in+vivo.">Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo.</a> Bioessays. , (2010).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li><li>Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Patrones estereotipados de proyección compuesto por dos tipos de formación de ramas axonal, junto con la facilidad de preparación en combinación con el uso de tejido fijado para DII etiquetado hace que la médula espinal de embriones con DRG adjunta un modelo favorable a estudiar la ramificación axonal. La aplicación de pequeñas cantidades de DII el uso de agujas de vidrio recubiertas permite - en contraste con el etiquetado mayor parte de DRG - la visualización de pequeños grupos de neuronas DRG y por lo tanto...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Estereomicroscopio Stemi República Democrática del Congo </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solución tampón de fosfato (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L182-50 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Merck </td><td> 8.18715.1000 </td><td></td></tr><tr><td> Estándar de tijeras quirúrgicas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 14001-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dientes de pinzas estándar </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11021-14 </td><td></td></tr><tr><td> Extra fino tijeras iris </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas curvas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11003-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont N º 5 puntas finas pinzas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 acabado de espejo fórceps </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11252-23 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas-Tübingen primavera tijeras </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 15008-08 </td><td></td></tr><tr><td> Papel de filtro </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB59041 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Instrumentos del Mundo Precisión </td><td> SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> De 100 mm cajas de Petri </td><td> Greiner </td><td> 663102 </td><td></td></tr><tr><td> 12 ml de polipropileno tubo </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> ECO3.1 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> De 12 y cultivo en placa </td><td> Becton Dickinson </td><td> 35-3043 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Merck </td><td> 1.00983.2500 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown extractor micropipeta P-97 </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vidrio de borosilicato capilares </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 30-0066 </td><td></td></tr><tr><td> DII (1,1 &#39;-dioctadecil-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetrametil - indocarbocyanine perclorato) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 468495 </td><td></td></tr><tr><td> Portaobjetos Superfrost Plus </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> H867.1 </td><td></td></tr><tr><td> Vidrio cubreobjetos </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> 1870.2 </td><td></td&gt; </tr></tbody></table>

dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord

Aquí se presenta una técnica para marcar la trayectoria de los pequeños grupos de neuronas DRG en la médula espinal de embriones mediante la tinción difusa con el trazador lipofílico 1,1 &#39;-dioctadecil-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DII) 1 . La comparación de las vías axonal de tipo salvaje con los de las líneas de ratón en el que los genes están mutados permite realizar pruebas para un papel funcional de las proteínas candidatas en el control de la ramificación axonal, que es un mecanismo esencial en el cableado del sistema nervioso. Ramificación axonal permite una neurona individual para conectarse con múltiples objetivos, proporcionando así la base física para el procesamiento paralelo de la información. Ramificaciones en las regiones objetivo intermedio de crecimiento axonal puede ser distinguida de arborización terminal. Además, los diferentes modos de formación de ramas axonal puede ser clasificado en función de si los resultados de la ramificación de las actividades del cono de crecimiento (división o un sostén retrasonching) o desde la brotación de las garantías del eje del axón en un proceso llamado intersticial ramificación 2 (Fig. 1). Las proyecciones centrales de las neuronas de los DRG ofrecer un sistema útil experimental para el estudio de ambos tipos de ramificación axonal: cuando sus axones aferentes llegar a la zona de la raíz dorsal de entrada (DREZ) de la médula espinal entre los días embrionarios 10 a 13 (E10 - E13) que muestran un patrón estereotipado de T o bifurcación en forma de Y. Los dos axones que resulta hija a continuación, proceder en sentido rostral o caudal, respectivamente, en el margen dorsolateral de la médula y sólo después de un período de espera colaterales brotan de estos axones madre para penetrar en la materia gris (intersticiales de ramas) y el proyecto de las neuronas de relevo en determinados láminas de la médula espinal donde se ramifican más (terminal de ramificación) 3. Trazados DII han revelado los conos de crecimiento en la zona de la raíz dorsal de entrada de la médula espinal que parecía estar en el proceso de dividir lo que sugiere que la bifurcación se produce por la división del cono de crecimiento en sí mismo 4 (Fig. 2), sin embargo, otras opciones han sido discutidos y 5. Este video muestra primero cómo diseccionar la médula espinal de los ratones E12.5 salir de la DRG adjunto. Después de la fijación de las cantidades pequeñas de muestra de DII se aplican a DRG el uso de agujas de cristal sacados de los tubos capilares. Después de una etapa de incubación, la médula espinal etiqueta se monta como un libro abierto invertido preparación para analizar los axones individuales mediante microscopía de fluorescencia.

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DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Las proyecciones estereotipadas de aferencias sensoriales en la médula espinal de roedores ofrecen un sistema experimental de fácil acceso para estudiar la ramificación axonal a través del rastreo de los axones individuales.

DII-etiquetado de las neuronas DRG para el Estudio de ramificación axonal en una preparación Todo el montaje del cable del ratón embrionario espinal

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

dii-labeling-drg-neurons-to-study-axonal-branching-whole-mount

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.8K vistas.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine. Las proyecciones estereotipadas de aferencias sensoriales en la médula espinal de roedores ofrecen un sistema experimental de fácil acceso para estudiar la ramificación axonal a través del rastreo de los axones individuales.

Video: DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Investigación

Neurociencias

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

Visualización del sistema nervioso embrionario en Todo el montaje Drosophila Los embriones

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Preparación Todo el montaje del Adulto Drosophila Cordón nervioso ventral para inyección gigante tinte de fibra

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Médula espinal inducida por láser Lesiones modelo para evaluar los mecanismos de degeneración axonal en tiempo real

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Preparación de mezcla de culturas gliales primarios de ratón adulto espinal tejido del cordón

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto<em&gt; Drosophila</emLos cerebros&gt;

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

El pez cebra<em&gt; In Situ</em&gt; Médula Espinal Preparación para Registros electrofisiológicos de Spinal Sensory y neuronas motoras

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motrices embrionarias<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminectomía e implantación de la ventana de la médula espinal en el ratón

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

DII-etiquetado de las neuronas DRG para el Estudio de ramificación axonal en una preparación Todo el montaje del cable del ratón embrionario espinal

Resumen

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Capítulos en este video

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Visualización del sistema nervioso embrionario en Todo el montaje Drosophila Los embriones

Preparación Todo el montaje del Adulto Drosophila Cordón nervioso ventral para inyección gigante tinte de fibra

Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el

Una

Preparación de mezcla de culturas gliales primarios de ratón adulto espinal tejido del cordón

Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto

El pez cebra

Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motrices embrionarias

Laminectomía e implantación de la ventana de la médula espinal en el ratón