Este protocolo permite evaluar posibles alteraciones morfológicas en las neuronas y las espinas dendríticas que pueden subrayar anomalías neuroquímicas y conductuales. Es único y útil para visualizar las neuronas en diferentes regiones cerebrales en ratas, que en combinación con un sofisticado software de reconstrucción permite a los investigadores dilucidar los posibles mecanismos subyacentes a la disfunción neurocognitiva. Comience preparando la solución PVP de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Llene el tubo con PVP y déjelo durante 20 minutos. Y expulsarlo por el otro extremo con una jeringa de 10 mililitros. Combinar 170 miligramos de perlas de microportadora de tungsteno con 250 microlitros de cloruro de metileno.
A continuación, vórtice a fondo la suspensión. A continuación, añadir 6 miligramos de DilC18(3) tinte lipofílico a 300 microlitros de cloruro de metileno y vórtice. Pipet 250 microlitros de la suspensión de cuentas de tungsteno en un portaobjetos de vidrio.
Espere a que la suspensión se seque al aire y agregue 300 microlitros de la solución de tinte. Una vez seca, usa una maquinilla de afeitar para dividir la mezcla en dos tubos centrífugos de 1,5 mililitros y llena los tubos con agua. Sonicar la mezcla en un baño de agua hasta que sea homogénea.
Asegurarse de que la punta del sonicador se encuentra directamente en los tubos. Combine las dos mezclas en un tubo cónico de 15 mililitros. Y sonicar durante otros tres minutos, asegurándose de que no queden grandes grupos de cuentas recubiertas de tinte.
Después de la sonicación, extraiga la mezcla en el tubo recubierto de PVP con una jeringa de 10 mililitros. Y alimenta el tubo a la estación de preparación. Gire el tubo durante un minuto.
Retire con cuidado toda el agua con una jeringa. Encienda el gas nitrógeno y ajuste el flujo de nitrógeno a aproximadamente 0,5 litros por minuto. Gire el tubo en la estación de preparación y séquelo con nitrógeno durante 30 minutos.
Retire el tubo de la estación y córtelo en segmentos de 13 milímetros con un cortador de tubos. Asegúrese de que la rata no responde a estímulos nocivos y que los reflejos están ausentes. A continuación, asegúrelo en la posición supina.
Haga una incisión a lo largo de la línea media torácica. Separe el diafragma y abra el pecho con tijeras. A continuación, inserte una aguja de calibre 20 de 25 milímetros en el ventrículo izquierdo.
Corte inmediatamente la aurícula derecha con tijeras y perfunda 15 mililitros de 100 PBS milimétricos con un caudal de 5 milímetros por minuto. A continuación, perfunde 100 mililitros de 4%PFA almacenados en búfer en PBS. Después de la perfusión, extirpa todo el cerebro de la rata.
Y postfir lo arregla con 4%PFA durante 10 minutos. Usa una matriz cerebral de rata para cortar la sección coronal de 500 micrómetros de espesor. Haga un corte de puño y mantenga la hoja en su lugar.
Luego haz un segundo corte con una segunda hoja y retira verticalmente la primera hoja, manteniendo el tejido en la superficie de la hoja. Coloque las rebanadas cerebrales en la placa de 24 pozos con 1 mililitro de PBS en cada pozo. Y repita el proceso hasta que se hayan cortado todas las rebanadas.
Retire PBS de cada pozo objetivo. Cargue el cartílago con la pieza de tubo de dil/tungsteno y colóquelo en el aplicador. Coloque un pedazo de papel de filtro entre las dos pantallas de malla.
Y conecte el aplicador a la manguera de helio. A continuación, ajuste la presión de salida de helio a 90 libras por pulgada cuadrada. Coloque el aplicador verticalmente en el centro del pozo de destino 1,5 centímetros entre la muestra y la pantalla de malla.
A continuación, dispare el tubo Dil/tungsteno. Cargue el cartílago con el siguiente tubo y dispare continuamente las perlas de la tubería en las rodajas restantes. Llene la placa de 24 pozos con 100 PBS mililares.
Y lave las rodajas tres veces con 500 microlitros de PBS fresco. Asegúrese de que las rodajas no se voltean durante el lavado. Cuando haya terminado, agregue 500 microlitros de PBS fresco a las rodajas.
Y incubarlos durante tres horas a cuatro grados Celsius en la oscuridad. Después de la incubación, usa un cepillo fino para transferir las rebanadas cerebrales a los portaobjetos de vidrio. Y añadir inmediatamente un mililitro de antifade medio de montaje a cada sección.
Coloque un cubreobjetos de 22 por 15 milímetros sobre las secciones y seque los portaobjetos en la oscuridad. Encienda el sistema de microscopio confocal y cambie a un objetivo 60X. Ajuste la configuración de imágenes de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Y obtener imágenes de pila Z para el tipo de neurona dirigida basada en los límites de la región cerebral y características morfológicas de las neuronas. Aísle la neurona cortical primaria de las ratas F344/N en el primer día posnatal y escálalas en un plato inferior de cristal de 35 milímetros durante una semana. Refrescante la mitad del medio en el tercer día después del aislamiento.
Lave el plato dos veces con 1 mililitro de 100 pliólonos PBS. Y fijar las celdas con 4%PFA durante 15 minutos a temperatura ambiente. Etiquete balísticamente las celdas como se describió anteriormente.
Y lávelos tres veces más con 1 mililitro de PBS. Añadir 500 microlitros de PBS a las células e incubarlos durante tres horas a cuatro grados Celsius en la oscuridad. A continuación, añada 200 microlitros de medio de montaje antifada.
Y obtener imágenes de la pila Z para cada neurona dirigida. Las neuronas piramidales típicas en la región del hipocampo en las secciones cerebrales de ratas se identificaron con tecnología de etiquetado balístico caracterizada por una gran dendrita apical y varias dendritas basales más pequeñas alrededor del soma. Se utilizó un software de análisis cuantitativo de reconstrucción neuronal para rastrear ramas dendríticas y detectar espinas.
Posteriormente, el software se utilizó para evaluar la complejidad de la ramificación dendrítica y la complejidad del árbol neuronal. Los cambios morfológicos en las espinas dendríticas se evaluaron utilizando la longitud, el volumen y el diámetro de la cabeza. Luego las espinas se clasificaron en espinas delgadas, rechonchas y de seta.
Y se examinó la frecuencia relativa del número de espinas entre cada radio. Más bien se validó la técnica de etiquetado balístico en una neurona piramidal primaria en el cultivo celular. Las neuronas piramidales fueron identificadas en base a la forma triangular del soma y la gran dendrita apical.
Luego se utilizó un software de reconstrucción neuronal para analizar la distribución de espinas dendríticas delgadas y la longitud de la columna vertebral dendrítica. Al intentar este protocolo, es importante evitar grandes grumos o racimos de tinte balístico recubierto de cuentas de tungsteno comenzando la preparación. Los grumos no permitirían distinguir las neuronas individuales.
Combinado con el software de reconstrucción neuronal este método nos permite examinar la morfología neuronal y dendrítica de la columna vertebral en neuronas piramidales hipocampales. El software de reconstrucción neuronal utiliza un algoritmo para ofrecer la clasificación asistida automática de las espinas dendríticas. La cuantificación de múltiples parámetros neuronales ofrece una oportunidad para entender mejor el mecanismo subyacente a la disfunción cognitiva neuronal.
