Este trabajo fue apoyado por el Consejo de institutos canadienses de investigación en salud, las ciencias naturales y la investigación en Ingeniería (NSERC Discovery Grant) y la Fundación de Saboya. OC fue apoyado por una beca de doctorado de NSERC.

Todos los experimentos fueron realizados siguiendo las directrices de bienestar animal de la Comisión de protección Animal de Université Laval y el Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal.
1. preliminar preparación (opcional: preparar 1 día de anticipación)
<ol><li>Preparar tres tipos de solución de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) (Normal, sacarosa y soluciones de recuperación, 1 L cada; ver tabla 1). Ajustar la osmolalidad de las soluciones a 300 ± 10 mOsm25 y enfriar la ACSF sacarosa hasta un punto cerca del punto de congelación (0-4 ° C). Nota: El uso de una solución de corte bajo en sodio (ACSF-sacarosa) ayuda a preservar la viabilidad de las neuronas en las capas superficiales de rebanadas agudo26.</li>
	<li>Preparar 0,75 mL de solución de parche que contiene un fluoróforo rojo (por ejemplo, Alexa-594) y un indicador de calcio sintético verde (p. ej., Oregon Green BAPTA-1; ver tabla 1). Incluyen la biocitina (ver tabla 1) en la solución de parche si post hoc la identificación morfológica de las células registradas.</li>
	<li>Ajustar la osmolalidad de la solución de 280 ± 5 mOsm y pH 7.35 ± 0.5. Mantener la solución en el refrigerador o en hielo en todo momento. Nota: Elección del indicador de calcio se debe basa su rango dinámico y la naturaleza de las Ca2 + eventos investigados.</li>
	<li>Utilizando un extractor de micropipeta, preparar pipetas de parche de Capillares de vidrio de borosilicato (véase Tabla de materiales) con una punta de 2 μm ≈ (resistencia de la pipeta de MΩ 3-5) y pipetas de estimulación de Capillares de vidrio de theta de borosilicato (véase tabla de Materiales) con una punta de 2-5 μm. Nota: La configuración del extractor para pipetas de un diámetro determinado y la forma se determinará por el tipo de filamento del extractor y resultados de la prueba de rampa para un determinado tipo de vidrio.</li>
</ol>2. hipocampo sector preparación
<ol><li>Anestesiar el ratón (P13-20; la tensión y el sexo del ratón viene determinado por la pregunta experimental se aborda) con 1 mL de isoflurano sobre una toalla de papel dentro de una cámara de narcosis por inhalación. Cuando el animal está anestesiado profundamente, según lo evidenciado por la falta de movimiento y la respiración lenta, retire de la cámara de narcosis y decapitar con una guillotina.</li>
	<li>Exponer el cráneo mediante la reducción de la piel con un pequeño par de tijeras de la parte posterior del cráneo a la nariz. Utilice un par de gubias hueso mini para hacer un agujero en el nivel de bregma. Luego utilice las tijeras para hacer un corte caudal a rostral a lo largo de la sutura sagital. Con las gubias Sujete la parte posterior de cada aleta de cráneo y levante hacia arriba y hacia afuera para extraer el cráneo cubriendo cada hemisferio.</li>
	<li>Después de que el cerebro está completamente expuesto, socavar los nervios ópticos con una pequeña espátula. El cerebro del cráneo y colocarlos en una placa Petri conteniendo continuamente oxigenada, frío ACSF-sacarosa (ver tabla 1 para la concentración de sacarosa).<ol>
<li>Si el tejido de los ratones más viejos se requiere, realizar una perfusión intracardiaca mediante una jeringa (25G) con 20 mL de helado ACSF-sacarosa antes de la extracción de cerebro para obtener rebanadas de buena calidad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se preparan rebanadas de hipocampales del cerebro de animales extraídos.<ol>
<li>Deje que el frío cerebro de alrededor de 2 minutos Coloque un pedazo de papel de filtro en una placa de Petri llenas de hielo, transferir el cerebro en el papel de filtro. Diseccionar los dos hemisferios.</li>
		<li>Los hemisferios disecados (la orientación se determina por el objetivo experimental para obtener rebanadas de coronal, transversal u horizontal) del pegamento en una mesa de vibratome y sumergirlo en la bandeja de vibratome con helada ACSF oxigenada-sacarosa. Hacer 300-μm rodajas gruesas en una temperatura de aproximadamente 1 ° C utilizando un vibratome refrigerador o colocar el hielo alrededor de la bandeja de vibratome.</li>
		<li>Usando una brocha plana, se acumulan las rebanadas con el hipocampo (para 6 rebanadas por hemisferio) en un baño que contiene oxigenado ACSF-recuperación calentado a 37 ° C.</li>
		<li>Deja las rodajas en el baño de la ACSF-recuperación de al menos 45 minutos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. celulares Patch-clamp grabaciones
<ol><li>Establecido una rebanada hipocampal en un baño colocado debajo del objetivo (aumento: 40 x, apertura numérica: 0.8) de un microscopio de dos fotones de escaneo láser. Continuamente inundar el baño con oxigenada ACSF Normal calentada a 30-32 ° C a una velocidad de 2,5-3 mL/min.</li>
	<li>Uso de contraste de interferencia diferencial infrarrojo (IR-DIC) o microscopía Dodt-SGC para localizar una celda de interés mediante su tamaño, forma y posición. Nota: Dependiendo de la población de neuronas específicas, un modelo de ratón transgénico puede utilizarse para localizar fácilmente las células de interés. En este caso, este paso puede reemplazarse con el uso de una fuente de luz fluorescente.</li>
	<li>Llenar una pipeta de estimulación con una solución de la ACSF Normal que contiene el fluoróforo rojo (por ejemplo, Alexa-594).</li>
	<li>Establece la pipeta de estimulación (conectada a una unidad de estimulación eléctrica) encima de la rebanada para que la punta esté en la misma región que la celda de interés.</li>
	<li>Después de llenar la pipeta del parche con solución de parche y conectarlo a una fase principal, ponerlo sobre la rebanada de modo que su punta esté directamente sobre la célula de interés.</li>
	<li>Encaja una llave de tres vías con una jeringa y conéctela a la pipeta de parche a través del tubo plástico. Inyectar una presión positiva constante en la pipeta de parche (≈ 0,1 mL) utilizando la jeringa. Mantenga la llave de paso en posición "close".</li>
	<li>Activar el módulo de software de control de amplificador e interruptor al modo de pinza de voltaje haciendo clic en el botón "VC". Abra el software de adquisición de datos de electrofisiología (p. ej., clampex) para adquisición de señales electrofisiológicas y haga clic en el icono de "Prueba de membrana" que continuamente envía un pulso de voltaje cuadrado (5 mV, 10 ms), que es necesario controlar cambios en la resistencia de la pipeta.</li>
	<li>Baje la pipeta de parche hasta que está justo encima de la celda objetivo. Al hacer contacto con la membrana celular, retire la presión girando la llave hasta la posición "abierta". Nota: El contacto con la membrana celular se detecta cuando un pequeño aumento en la resistencia de la pipeta (≈ 0.2 MΩ) se ve y una pequeña hendidura en la célula es causada por la presión positiva.</li>
	<li>Aplicar una ligera presión negativa en la pipeta patch usando una jeringa de vacíela instalada en la llave de paso hasta que llegue a la resistencia de pipeta proporcionada por el software de 1 GΩ. En la ventana de 'Test de membrana' del software de adquisición de datos, fije la celda a -60 mV.</li>
	<li>Siga aplicando presión negativa hasta que la célula se abre y se logra la configuración de célula entera. Detección de este estado de la célula se basa en el cambio repentino en la resistencia de la pipeta (de 1 GΩ a MΩ 70-500 dependiendo del tipo de interneurona) y la aparición de grandes transitorios capacitivas en la ventana de 'Test de membrana'.</li>
</ol>4. dos fotones Ca2 + imagen
<ol><li>Si está interesado en las respuestas postsinápticas excitatorias, añadir el gabazine de bloqueador de receptor GABAA (10 μm) y el bloqueador de los receptores GABAB CGP55845 (2 μm) en el baño de la ACSF.</li>
	<li>En el módulo de software de control de amplificador, establecer la configuración de parche a pinza de corriente haciendo clic en el botón "CC" y registrar el patrón de la leña de la célula en respuesta a las inyecciones somáticas de la corriente de despolarización (0.8-1.0 nA, 1 s). Espere al menos 30 min para la célula que se llena de los indicadores presentes en la solución de parche. Nota: La celda patrón de disparo y propiedades activas se pueden utilizar para identificar el subtipo de la célula; por ejemplo, las células rápido disparando. Es importante para la concentración de indicador estabilizar a través de la difusión antes de comenzar a grabar gatos (ver tabla 2 para la solución de problemas).</li>
	<li>AP-evocado gatos<ol>
<li>Utilizando el software de adquisición de imagen, iniciar la adquisición de imágenes. Localizar una dendrita de interés utilizando la señal de fluorescencia roja. Para asegurar una respuesta visible, primero, elegir una dendrita proximal (≤ 50 μm) como la eficiencia de AP backpropagation puede disminuir significativamente con la distancia de interneuronas GABAérgicas22.</li>
		<li>Utilizando la herramienta' rectangular' en el software de adquisición de imagen, zoom en la región de destinada y cambiar a la "xt" (linescan) modo. Posición la exploración a través de la rama dendrítica de interés. Con los controladores de intensidad del laser en el software de adquisición, establecer el régimen de dos fotones láser a un nivel de mínima energía donde la fluorescencia basal verde es poco visible, para evitar fototoxicidad.</li>
		<li>En el software electrofisiología de adquisición de datos software de adquisición de imagen y de ventana de 'Protocolo', crear un ensayo de grabación de la duración deseada que contenga una inyección actual somática de la amplitud deseada.<ol>
<li>Utilizando el software de adquisición de imagen, haga clic en el botón "Start record" y adquirir la fluorescencia continuamente durante 1-2 s. repetir la adquisición de la imagen 3 - 10 veces. Espere al menos 30 s entre exploraciones solo para evitar el fotoenvejecimiento. Si adquirir linescans en múltiples puntos a lo largo de una dendrita, llevarlos en orden aleatorio para evitar efectos de orden.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>CCIS-evocado gatos<ol>
<li>Localizar una dendrita de interés utilizando la señal de fluorescencia roja.</li>
		<li>Ponga la pipeta de estimulación sobre la superficie de la rebanada sobre la dendrita de interés. Baje lentamente la pipeta de estimulación en su lugar, reduciendo al mínimo movimiento para evitar alterar la configuración de célula entera. Coloque la pipeta en 10-15 μm de la dendrita.</li>
		<li>Para visualizar la ubicación de microdominios sináptica en las dendritas aspiny, en el software de adquisición de la imagen pase a la 'xt' (linescan) modo y posición de la línea a lo largo de la rama dendrítica de interés.</li>
		<li>En la ventana de 'Protocolo' (de software de adquisición de datos de electrofisiología) y software de adquisición de imagen, crear un estudio de grabación que activa la unidad de estimulación después del comienzo de la prueba.</li>
		<li>Utilizando el software de adquisición, haga clic en el botón "Start record" para explorar a lo largo de la dendrita continuamente para adquisición de repetir s. 1-2 3 - 5 veces, esperar 30 s entre exploraciones para prevenir el fotoenvejecimiento. Nota: La longitud de exploración puede ajustarse dependiendo de la cinética del evento evocado, pero debe reducirse para evitar el fotodaño (ver tabla 2 para la solución de problemas).</li>
		<li>Repita el paso 4.5.5 en diferentes condiciones (por ejemplo, diferente intensidad, longitud de la estimulación, la introducción de un bloqueador de farmacológico, etc.) dependiendo de la pregunta concreta que se aborda.</li>
		<li>Detener la adquisición cuando la célula muestra signos de deterioro de la salud: despolarización por debajo de -45 mV, aumento en la línea de base nivel de Ca2 + , deterioro morfológico de las dendritas (por ejemplo, el blebbing, fragmentación; ver tabla 2 para la solución de problemas).</li>
		<li>Para obtener información preliminar sobre la morfología de la célula y mantener un registro de la ubicación de la pipeta de estimulación, adquirir una Z -pila de la célula en el canal rojo. Utilizando el software de adquisición de 'xyz' modo, establecer los límites superior e inferior de la pila a toda la célula de la imagen con todos los procesos incluidos. La magnitud en 1 μm e iniciar la adquisición de la pila utilizando el botón "Iniciar registro".</li>
		<li>Cuando la Z-pila adquisición es completa, utilice la opción de "Proyección de la máxima" en el software para superponer todos los planes focales de la pila y Compruebe la calidad de la adquisición. Entonces, retraiga lentamente la pipeta del parche de la rebanada.</li>
		<li>Para corregir el slice para identificación morfológica post hoc , rápidamente retirar el segmento del baño utilizando un pincel plano y colocar entre dos papeles de filtro, en un plato de Petri llenas de ACSF. Vuelva a colocar la ACSF con una solución al 4% paraformaldehido (PFA) y dejar el plato en una habitación de 4 ° C o el refrigerador durante la noche.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. inmunohistoquímica para Post Hoc identificación morfológica de las células registradas
Nota: Después de 1 noche de fijación en la PFA, el segmento puede almacenarse en tampón de fosfato (PB) con azida de sodio (0,5%) durante 1 mes.
<ol><li>Poner la rodaja en solución salina tamponada con Tris (TBS) con Triton X-100 (0.3%) y realizar 4 lavados (5-10 minutos cada uno).</li>
	<li>Poner la rodaja en TBS-Triton 0.3% con 10% de suero normal de cabra (NGS) durante 1 hora.</li>
	<li>Poner la rodaja en TBS-Triton 0.3% 1% NGS y un fluoróforo conjugado estreptavidina (p. ej., Alexa Fluor 546 conjugado estreptavidina, 1: 200) para la noche incubación.</li>
	<li>Lavar 4 veces (5-10 min) en TBS.</li>
	<li>Monte rebanadas en imagen con un microscopio confocal y microscopio. Para que una reconstrucción completa de la célula, adquirir un Z-stack (tamaño de paso: 1 μm) usando un objetivo de 20 x. Para una etiqueta de Alexa-546-conjugado de la proyección de imagen, uso que un 543 nm láser y una detección de 515-560 nm filtro establecido.</li>
</ol>6. Análisis de los gatos
<ol><li>Extraer los valores de fluorescencia de las regiones de interés (ROIs) en las imágenes de linescan de los canales rojo y verdes y promedio de los valores de las múltiples repeticiones para cada condición reducir el ruido. Nota: Cuando linescan adquisición se realiza a lo largo de la dendrita, es posible extraer datos de varios reyes, que pueden corresponder a microdominios dendríticas (2-5 μm), y permitiendo el estudio de la compartimentalización señal de Ca2 + .</li>
	<li>Cada ROI, expresan los cambios en el Ca2 + amplitud como: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56776/56776eq1.jpg"> Nota: Aquí G es el valor de fluorescencia del canal verde; G0 es el valor de fluorescencia de línea de base del canal verde durante el período de estimulación previa; R es el valor de fluorescencia de la canal rojo18. Excitación de dos fotones es muy localizada y no genera un fondo importante, resta de la fluorescencia de fondo no es necesario.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons.">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li><li>Yuste, R., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+as+basic+functional+units+of+neuronal+integration.">Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration.</a> Nature. 375, 682-684 (1995).</li><li>Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Dendritic+Spines.">Structure and Function of Dendritic Spines.</a> Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).</li><li>Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+calcium+channels+in+single+spines+using+optical+fluctuation+analysis.">Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis.</a> Nature. 408, 589-593 (2000).</li><li>Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+calcium+transients+in+single+spines+indicate+that+NMDA+receptors+are+not+saturated.">Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated.</a> Nature. 399, 151-155 (1999).</li><li>Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+calcium+channels+in+dendritic+spines.">Plasticity of calcium channels in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).</li><li>Carter, A. G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+calcium+signaling+in+dendritic+spines+of+striatal+medium+spiny+neurons.">State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons.</a> Neuron. 44, 483-493 (2004).</li><li>Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+metabotropicglutamate+receptor-+and+AMPA+receptor-mediated+dendritic+Ca2++signals+by+presynaptic+and+postsynaptic+activity+in+hippocampal+interneurons.">Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).</li><li>Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+compartmentalized+regulation+of+dendritic+Ca2++signaling+in+hippocampal+interneurons.">Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+nonlinearities+switch+the+direction+of+synaptic+plasticity+in+fast-spiking+interneurons.">Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons.</a> J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).</li><li>Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thespread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+release+of+Ca2++from+IP3-sensitive+stores+evoked+by+synaptic+activation+of+mGluRs+paired+with+backpropagating+action+potentials.">Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials.</a> Neuron. 24, 727-737 (1999).</li><li>Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+subthreshold+Ca(2+)+signals+in+spines+of+hippocampal+neurons.">NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++imaging+of+mouse+neocortical+interneurone+dendrites:+contribution+of+Ca2+-permeable+AMPA+and+NMDA+receptors+to+subthreshold+Ca2++dynamics.">Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics.</a> J Physiol. 551, 67-78 (2003).</li><li>Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dendritic+calcium+spikes+in+mouselayer+5+low+threshold+spiking+interneurones:+implications+for+control+of+pyramidal+cell+bursting.">Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting.</a> J Physiol. 558, 465-478 (2004).</li><li>Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+single+synapses+in+brain+slices.">Functional imaging of single synapses in brain slices.</a> Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).</li><li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments.">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Sci STKE. 219, pl5 (2004).</li><li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. 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C., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Signaling+in+Inhibitory+Interneurons:+Local+Tuning+via+Group+I+Metabotropic+Glutamate+Receptors.">Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors.</a> Front Physiol. 3, 259 (2012).</li><li>Bourque, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+mechanisms+of+osmosensation+and+systemic+osmoregulation.">Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation.</a> Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).</li><li>Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices.">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li><li>Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+two-photon+uncaging:+anovel+approach+to+mapping+glutamate+receptors.">Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors.</a> Neuron. 19, 465-471 (1997).</li><li>Salom&#233;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+usingacousto-optic+deflectors.">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).</li><li>Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+laser+scanning+microscopy+using+an+acoustic+optical+deflector.">Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector.</a> Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).</li></ol>

Los autores tienen ninguna competencia intereses financieros u otros conflictos de intereses.

El método que se muestra a continuación muestra cómo la combinación de dos fotones Ca2 + proyección de imagen y electrofisiología patch-clamp se puede utilizar para estudiar dendríticas Ca2 + en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro agudo. Este método permite el control de ambos el local Ca2 + elevaciones evocadas por AP eléctrico de estimulación o backpropagating en segmentos dendríticos y la respuesta somática de la célula. Esta es una excelente herramienta para ...

La contribución de una neurona a la actividad de la red está determinada por la naturaleza dinámica de las entradas sinápticas que recibe. Tradicionalmente, el método predominante de caracterizar la actividad sináptica en las neuronas dependía de grabaciones somáticas celulares-abrazadera del remiendo de corrientes postsynaptic evocadas por la estimulación eléctrica de los axones de paso. Sin embargo, única actividad de la sinapsis situada proximally se divulga con la verdad en este caso1. Además, para evaluar los mecanismos específicos de la sinapsis, se han utilizado grabaciones de pares de neuronas y dendritas en un lugar específico a las sinapsis de interés y los mecanismos de integración dendrítica, respectivamente. Se logró un gran avance en el campo de la Fisiología sináptica a través de una combinación de técnicas ópticas y electrofisiológicas. Láser de excitación de dos fotones microscopía (2PLSM) en combinación con herramientas de optogenetic y Ca2 + la proyección de imagen puede revelar grandes detalles de la organización dinámica de la actividad sináptica en las conexiones neuronales específicas en rebanadas de cerebro en Vitro e in vivo.
Varias ventajas claves hecho 2PLSM sobresalen la excitación convencional, un fotón microscopia2: (1) debido al carácter no lineal de excitación de dos fotones, la fluorescencia se genera solamente en el volumen focal, y representan todos los fotones emitidos señales útiles (sin necesidad de agujero de alfiler); (2) más de largo longitudes de onda, utilizados en 2PLSM, penetran en el tejido de dispersión más eficiente; Además, los fotones dispersos son demasiado diluidos para producir la excitación de dos fotones y la fluorescencia del fondo; (3) fotoenvejecimiento y fototoxicidad también se limitan al plano focal. Por lo tanto, a pesar del alto costo de los sistemas 2-fotón en comparación con los microscopios confocales convencionales, la 2PLSM sigue siendo un método de elección para la investigación de alta resolución de la estructura neuronal y función en tejido grueso vivo.
El primer uso de 2PLSM en el tejido de dispersión fue la imagen de la estructura y función de espinas dendríticas3. 2PLSM en combinación con Ca2 + la proyección de imagen ha revelado esa función de espinas como compartimientos bioquímicos aislados. Ya que en muchos tipos neuronales existe una correspondencia biunívoca entre espinas y las sinapsis individuales4, dos fotones Ca2 + imagen pronto se convirtió en una útil herramienta de reporting de la actividad de las sinapsis individuales en el tejido intacto5, 6,7,8. Además, basado en la 2PLSM Ca2 + proyección de imagen fue utilizado con éxito para supervisar la actividad de los canales de calcio solo y las interacciones no lineales entre las conductancias intrínsecas y sinápticas, así como para evaluar el estado y actividad dependiente regulación de Ca2 + en las dendritas neuronales5,6,7,8,9,10,11.
El calcio es un segundo mensajero intracelular ubicuo y su organización espacio-temporal subcelular determina la dirección de las reacciones fisiológicas, de los cambios en fuerza sináptica a la regulación de iones canales, crecimiento de la dendrita y la columna vertebral, como así como la muerte celular y la supervivencia. Dendríticas Ca2 + elevaciones se producen mediante la activación de múltiples vías. Potenciales de acción (APs), backpropagating a las dendritas, abre voltaje-bloqueado calcio canales12 y producir a relativamente global Ca2 + transitorios (gatos) en las dendritas y espinas13. Transmisión sináptica se asocia con la activación de postsynaptic Ca2 +-permeables receptores (NMDA, Ca2 +-permeable al AMPA y kainato), activación sináptica gatos de14,6,15. Por último, pueden generarse supralinear Ca2 + eventos en dendritas bajo ciertas condiciones11,12,13,16.
Emplea dos fotones Ca2 + proyección de imagen en combinación con las grabaciones electrofisiológicas abrazadera del remiendo sintético Ca2 +-indicadores fluorescentes sensibles, que por lo general se entregan a través de los electrodos de parche durante grabaciones de celulares . Un método estándar para la cuantificación de la dinámica de Ca2 + se basa en el método de doble indicador17,18. Utiliza dos fluoróforos con espectros de emisión bien separados (p. ej., una combinación de un rojo Ca2 +-insensible tinta verde Ca2 + indicadores, tales como verde de Oregon BAPTA-1 o Fluo-4) y tiene varias ventajas en comparación con el método de indicador único. Primero, una Ca2 +-insensible tinte se utiliza para localizar pequeñas estructuras de interés (ramas dendríticos y espinas) donde se realizará la proyección de imagen de Ca2 + . En segundo lugar, la relación entre el cambio en la fluorescencia verde y rojo (ΔG/R) se calcula como una medida de la [Ca2 +], que es en gran parte insensible a los cambios en la fluorescencia basal debido a fluctuaciones en la [Ca2 +]017 , 18. por otra parte, cambios de fluorescencia pueden ser calibradas en términos de absoluta Ca2 + concentraciones19.
Una preocupación general cuando dos fotones Ca2 + de los experimentos en rebanadas agudos es celular salud y estabilidad de la adquisición de la imagen debido a la potencia del láser alta que normalmente se utiliza. Además, en experimentos de Ca2 + proyección de imagen, hay preocupación por la perturbación y considerable sobreestimación de subcelular Ca2 + dinámica debido a que los indicadores de Ca2 + actúan como móvil altamente exógeno Ca2 + almacenadores intermediarios. Por lo tanto, la elección del indicador de Ca2 + y su concentración depende del tipo neuronal, la amplitud esperada de gatos y de la pregunta experimental.
Adaptamos el método de dos fotones Ca2 + proyección de imagen para investigación de Ca2 + las fluctuaciones en las dendritas de GABAérgico interneuronas9,10,11,20,21 , 22. mientras que la mayor parte de los primeros Ca2 + imagen estudios se realizaron en las principales neuronas, inhibitorios interneurons mostrar una gran variedad de funciones Ca2 + mecanismos que son distintas a las de las células piramidales20 , 23 , 24. estos mecanismos específicos de interneurona (p. ej., Ca2 + permeable AMPA receptores) pueden desempeñar papeles específicos en la regulación de la actividad de la célula. Dendríticas Ca2 + en interneuronas es un objetivo tentador para la posterior investigación, dos fotones Ca2 + en las dendritas de estas células presenta desafíos adicionales, de un diámetro más fino de las dendritas y la falta de espinas para una particularmente alta Ca2 + vinculante capacidad endógena. Como nuestra investigación intereses se centran en el estudio de interneurons hippocampal, el siguiente protocolo, si bien aplicable a distintas poblaciones neuronales, fue adaptado para hacer frente a esos desafíos.
Este protocolo fue ejecutado con un microscopio confocal comercial de dos fotones, que fue equipado con dos detectores externos, no descanned (NDDs), modulador electro-óptico (MOE) y un Dodt exploración contraste degradado (SGC) e instalado sobre una mesa óptica. El microscopio fue juntado con un láser de TI: zafiro multifotón modo-bloqueado a 800 nm (> 3 W 140 pulsos de fs, tasa de repetición de 80 Hz). El sistema de proyección de imagen fue equipado con una plataforma de electrofisiología estándar, incluyendo una cámara de perfusión con control de temperatura, una plataforma de traducción con dos micromanipuladores, un amplificador controlado por ordenador del microelectrodo, un digitalizador, un estímulo unidad y software de adquisición de datos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Animal Strain: Mouse CD1&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Charles River</td>
			<td style="width:159px;">022</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:148px;">AbbVie Corporation</td>
			<td>0B506-099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CGP 55845 hydrochloride&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-(+)-Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Magnesium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde powder, 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Potassium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Potassium gluconate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium azide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma hydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Sodium phosphate monobasic 
			monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor 594 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">A10438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">SR95531 (Gabazine)&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Abcam</td>
			<td style="width:159px;">ab120042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Adenosine triphosphate (ATP)-Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:239px;"> 
			Guanosine (GTP)-Na+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Oregon Green BAPTA-1</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Phosphocreatine di(tris) salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Streptavidin-conjugated Alexa-546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Patch Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Theta Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BT-150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td style="width:148px;">Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser&#160;</td>
			<td>Coherent</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">LAS AF Imaging Acquisition Software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Temperature Controller TC-324B</td>
			<td style="width:148px;">Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			MultiClamp 700B Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Digidata 1440A Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Confocal Translator</td>
			<td style="width:148px;">Siskiyou</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Micromanipulator</td>
			<td style="width:148px;">Siskiyou</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			pClamp Data Acquisition Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			A365 Constant Current Stimulus Isolator</td>
			<td style="width:148px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Vibraplane Optical Table</td>
			<td style="width:148px;">Kinetic Systems</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon calcium imaging in neuronal dendrites in brain slices

Proyección de imagen de calcio (Ca2 +) es una herramienta poderosa para investigar la dinámica espacio-temporal de Ca2 + señales intracelulares en las dendritas neuronales. CA2 + las fluctuaciones pueden ocurrir a través de una variedad de membranas y mecanismos intracelulares y juega un papel crucial en la inducción de la plasticidad sináptica y la regulación de la excitabilidad dendrítica. Por lo tanto, la capacidad para registrar diferentes tipos de señales de Ca2 + en ramas dendríticas es valiosa para estudiar cómo las dendritas integran información de grupos. El advenimiento de la microscopía de dos fotones ha facilitado este tipo de estudios significativamente mediante la solución de los problemas inherentes a la proyección de imagen en tejido vivo, como la dispersión de la luz y fotodaño. Además, a través de la combinación de técnicas electrofisiológicas convencionales con dos fotones Ca2 + proyección de imagen, es posible investigar local Ca2 + las fluctuaciones en las dendritas neuronales en forma paralela a las grabaciones de la actividad sináptica en Soma. Aquí, describimos cómo utilizar este método para estudiar la dinámica de local Ca2 + transitorios (gatos) en las dendritas de las interneuronas inhibitorias GABAérgicas. El método puede ser aplicado también al estudio de dendríticas Ca2 + en diferentes tipos neuronales en rebanadas de cerebro agudo.

Utilizando el protocolo presentado aquí, obtuvimos gatos evocados por inyección actual somática y por estimulación eléctrica en las dendritas de las interneuronas oriens/alveus en el área CA1 del hipocampo. Después de remendar una neurona, identificada en su forma y posición base, hemos adquirido el linescans a través de una dendrita proximal en varios puntos en el dado Distancias desde el soma (figura 1A). Se observó una disminución en la amplitud...

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Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Se presenta un método que combina grabaciones de celulares-abrazadera del remiendo y la proyección de la imagen de dos fotones para registrar a transitorios de Ca2 + en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro agudo.

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

two-photon-calcium-imaging-in-neuronal-dendrites-in-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K vistas.  Université Laval. Se presenta un método que combina grabaciones de celulares-abrazadera del remiendo y la proyección de la imagen de dos fotones para registrar a transitorios de Ca2 + en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro agudo.

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Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Investigación

Neurociencias

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

En Vivo Cerebral Funcional Imaging Enfoque Basado en calcio bioluminiscente Indicador GFP-aequorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablación de una población Neuronal utilizando un láser de dos fotones y su evaluación mediante grabación comportamiento y proyección de imagen de calcio en las larvas de pez cebra

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

En Vivo Proyección de imagen de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

Proyección de imagen de dos fotones de atracción Microglial procesos hacia ATP o serotonina en rebanadas de cerebro agudo

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...