Este trabajo fue apoyado por 115 347-RSG-08-271-01-GMC de ACS, y por CA138631 subvención de los NIH.

El protocolo fue adaptado originalmente de B. Ren, 2001. Que representa una ligera modificación del protocolo de Odom et al. 5, que se puede encontrar en <a href="http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads">http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads</a> 1. Pre-bloque y la unión del anticuerpo a perlas magnéticas (En caso de llevarse a cabo la noche antes de que el siguiente paso) <ol><li> Lavado de 100 L de Dynabeads proteína G (por IP, se combinan para múltiples IPs) en 1 ml de agua dulce BSA / PBS solución (50 mg de BSA en 10 ml de PBS-Esta solución tendrá una duración de una semana). </li><li> Recoge las cuentas con un soporte magnético y repetir el procedimiento de lavado dos veces más. </li><li> A continuación, agregar 10 mg de anticuerpos frente a 250 l de la suspensión de cuentas en PBS / BSA solución (por IP) e incubar durante la noche sobre una plataforma giratoria a 4 ° C. </li><li> Al terminar, lavar las cuentas tres veces en 1 ml de la solución de PBS / BSA y luego volver a suspender en 10 l de la solución de PBS / BSA (por IP). </li></ol> 2. Células de entrecruzamiento <ol><li> Para iniciar este procedimiento, creciendo aproximadamente 10 8 células por inmunoprecipitación, o IP. Aquí, difusa histiocitos U937 linfoma se utilizan y se indujo la diferenciación de monocitos con TPA durante 96 horas. </li><li> Siguiendo el crecimiento celular, agregar una solución de formaldehído directamente a los medios de comunicación a una concentración final de 1%. Luego, haga girar la breve frascos y les permitan permanecer a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, aspirar los medios de comunicación y aclarar las células con 15 ml de helado de PBS. Repetir este lavado una vez. </li><li> A continuación, añadir 6 mL de tampón de lisis 1 (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% de glicerol, 0,5% NP-40, 0,25% de Triton X-100, que contiene inhibidores de la proteasa) para cada uno de los frascos en el hielo. Entonces, el rock los frascos durante 20 minutos a 4 ° C. </li><li> Por último, la cosecha de las células utilizando un rascador de células y transferirlos a tubos cónicos de 15 ml. En este punto, las células pueden ser almacenadas a -80 ° C. </li></ol> 3. Sonicación celular <ol><li> Si las células fueron congeladas, a descongelarse. Una vez descongelado, girar las células hacia abajo a 3.000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C y descartar el sobrenadante. A continuación, volver a suspender las células en 6 ml de tampón de lisis 2 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, que contienen inhibidores de la proteasa). Roca de los tubos suavemente a temperatura ambiente durante 10 minutos. </li><li> Repetir la centrifugación y se resuspenden las células en 2,5 ml de tampón de lisis 3 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1% de desoxicolato de sodio, 0,5% de N-lauroylsarcosine, que contienen inhibidores de la proteasa) . </li><li> A continuación, preparar la suspensión de ultrasonidos, colocándolo en un vaso de agua helada con la micropunta de un Sonifier Branson 450 establece que entre el 50 y el 60% de la amplitud. </li><li> Sonicar la solución para un estallido constante de 30 segundos y enfriar en hielo durante 1 minuto. Repita estos pulsos de 10 a 15 veces. Luego, pipeta el contenido del tubo de arriba a abajo y transferirlos a un nuevo tubo. Siguen el pulso y enfriar la solución de un adicional de 5 veces. </li><li> Después de sonicación, añadir 10% de Triton X-100 a 1 / 10 del volumen de la solución. La transferencia de los lisados ​​a tubos de 1,5 ml de centrífuga, y el giro de los escombros en una microcentrífuga. Luego transferir el lisado celular a un tubo nuevo. </li></ol> 4. Inmunoprecipitación de cromatina <ol><li> Antes de la inmunoprecipitación de la cromatina, o chip, ahorrar un 50 l del lisado celular como la muestra de entrada. Luego, combine el lisado celular aclarado con Dynabeads pre-unida al anticuerpo que han sido previamente preparado como se describió anteriormente. Roca de la mezcla, además de la muestra de entrada de 50 l, a 4 ° C durante la noche. </li><li> Lavar las perlas con 1 mL del tampón de lavado (50 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 0,5 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,7% desoxicolato de sodio, 1% NP-40). Luego, utilice un soporte magnético para recoger las cuentas y eliminar el sobrenadante. Repita este lavado de 6 a 8 veces. </li><li> Realizar un lavado final con 1 ml de TE-plus-50 mM de NaCl (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). Girar las bolas en una microcentrífuga a 3.000 rpm durante 2 minutos a 4 ° C. Después del centrifugado, aspirar cualquier residuo de buffer TE. </li><li> A continuación, añadir 100 ml de tampón de elución (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS) a las muestras. Inmediatamente después, incubar las muestras a 65 ° C durante 10 a 15 minutos. Cero de los tubos contra un soporte de tubos de 1,5 ml cada 2 minutos para mantener las cuentas en la suspensión. </li><li> Recoge las cuentas usando la centrifugación y el soporte magnético, y la transferencia del sobrenadante a un tubo de PCR. A continuación, recuperar la muestra de entrada guardada anteriormente y agregar 3 volúmenes de tampón de elución. </li><li> Por último, coloque las muestras de IP y de entrada en el termociclador durante la noche a 65 ° C arevertir las relaciones cruzadas. </li><li> Al día siguiente, agregue un volumen de buffer TE a las muestras. A continuación, añadir RNasa A a una concentración final de 0,2 mg / mL. Incubar las muestras en el termociclador durante 1 a 2 horas a 37 ° C. </li><li> Después de la incubación, añadir proteinasa K a una concentración final de 0,2 mg / mL. A continuación, se incuban las muestras en el termociclador a 55 ° C durante 2 horas. </li><li> A continuación, el extracto de las muestras una vez con un volumen de fenol. Extraer las muestras por segunda vez con un volumen de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico. Finalmente, el extracto de las muestras una vez más, con un volumen de cloroformo: alcohol isoamílico. </li><li> A continuación, añadir 30 g de glucógeno a cada muestra. Además, añade NaCl a una concentración final de 0,2 volúmenes molares y dos de etanol a las muestras. Incubar por 30 minutos a -80 ° C. Después de la incubación, girar las muestras y recoger el sobrenadante. Lavar los pellets con 500 l de etanol al 75%. A continuación, los pellets seco y volver a suspender en 40 ml de agua. </li><li> Para comprobar el tamaño de los fragmentos de ADN producidos por el procedimiento de ultrasonidos, la carga de 5 mg de la muestra de entrada purificado en un 1,8% en gel de agarosa y ejecutar el gel. El procedimiento de ultrasonidos que producen fragmentos en el rango de 150-350 pares de bases. Sin embargo, si los fragmentos no están en este rango, el procedimiento de ultrasonidos debe ser ajustada por la variación del número de explosiones y la amplitud. </li><li> Para comprobar la solidez y la especificidad del chip, el enriquecimiento de las regiones controlan el enlace mediante la realización de los genes específicos de PCR con 1 l de las muestras de IP y una serie de diluciones de la muestra de entrada. Dos o tres &quot;consolidados&quot; las regiones y una región de control independiente deben ser seleccionados con el fin de probar la calidad de las muestras de IP y de entrada. </li></ol> 5. Amplificación de ADN genómico <ol><li> A partir de 34 l de la muestra IP o 200 ng de la muestra de entrada, realizar la reparación final, &#39;A&#39; además de la cola y la ligadura de los adaptadores a los fragmentos de ADN utilizando ADN genómico preparación de muestras Kit <a href="http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn">http://www.illumina.com/systems/ genome_analyzer.ilmn</a> (Illumina, Inc., San Diego, CA). </li><li> Purificar el ADN utilizando un kit de PCR Purificación MinElute y luego eluir en tampón EB (10 mM Tris Cl, pH 8,5) que ha sido previamente calentada a 50 ° C. Por ejemplo, utilice 23 ly 46 l para la elución final de la IP y las muestras de ADN de entrada, respectivamente. </li><li> Que la reacción de PCR utilizando 23 L de ADN con los adaptadores, y 25 de la polimerasa de ADN l Phusion del kit, 1 l de 20 mM Sol_PCR_1, y 1 l de 20 mM Sol_PCR_2. Ejecutar la reacción de PCR de la siguiente manera: 1) 30 segundos a 98 ° C, 2) 10 segundos a 98 ° C, 3) 30 segundos a 65 ° C, 4) 30 segundos a 72 ° C, repitiendo los pasos pasos 2-4 18 veces y luego 5 minutos a 72 ° C, finalmente, mantenimiento a 4 ° C. </li><li> Después de la amplificación por PCR, purificar el ADN con el kit de QIAGEN MinElute Purificación de PCR. Pre-caliente 15 l de tampón EB a 50 ° C y eluir el ADN. Diluir 0,5 l de la muestra 1:4 y realizar una lectura Nanodrop. </li></ol> 6. Gel de purificación de los productos amplificados <ol><li> Para purificar los productos amplificados, preparar un gel de agarosa al 1,8% de 50 ml con agua grado HPLC. Añadir TAE y bromuro de etidio después de la agarosa se haya derretido. Luego, vierta el gel. Cargar el gel después de añadir 4 l de tampón de carga a la entrada y las muestras de IP. A continuación, ejecute el gel a 120 voltios durante 45 minutos. </li><li> Analizar el gel después de que se ha ejecutado. El gel debe revelar que los fragmentos en el rango entre 150 y 350 pares de bases se producen. Que representan fragmentos de ADN genómico de entre 50 y 250 pares de bases de longitud y un adaptador. </li><li> Impuestos Especiales de la región del gel que contiene el material en el rango de 150 350 pares de bases con un bisturí. Tenga cuidado para evitar la escisión de la banda adaptador adaptador, que se cifra en unas 120 pares de bases. Recuperar el ADN utilizando un kit de extracción de gel QIAquick las instrucciones del fabricante. En concreto, el uso de una columna del kit de extracción QIAquick Gel para una rebanada de gel de 400 mg o menos. Para comenzar el proceso de extracción, agregar 3 volúmenes de buffer QG a un volumen de gel. Añadir 1 volumen de isopropanol y la carga de la mezcla en la columna. Use 0,5 ml de QG para lavar la columna, seguido por el procedimiento estándar descrito en el juego de manual. Use H 2 O pre-calentado a 50 ° C para eluir el ADN. Incubar la columna con 30 l de H 2 O durante 5 minutos a 37 ° C antes de girar hacia abajo. </li><li> Secar la muestra hasta 11 l, precisamente en un Speedvac sin calor. Quitar una L de la muestra y medir la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro Nanodrop. </li><li> Por último, identificar los productos enriquecidos con el gen del genoma Illumina AnalyzerIIe como se describe en <a href="http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf">http://genesdev.cshlp.org/content/suppl</a>/ 2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf 6. </li></ol> 7. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. El objetivo general de la siguiente experimento consiste en identificar los objetivos de la genómica KDM5A/JARID1A/RBP2 desmetilasa histonas. (P1) Esto se logra mediante la preparación de enlaces cruzados de la cromatina que se somete a sonicación para producir fragmentos de ADN de tamaño apropiado. (P2) En un segundo paso, RBP2 fragmentos de ADN están obligados immunoprecipitated con RBP2 anticuerpos. (P3) A continuación, los fragmentos de ADN recuperado se reparan en los extremos y los adaptadores se ligan a los extremos de ADN genómico para preparar las bibliotecas de ADN genómico para el análisis de las células de flujo en la estación de racimo Illumina. Las bibliotecas de ADN amplificado por PCR utilizando bajo número de ciclos. (P4) Por último, Illumina secuencia corta lee son los únicos alineados con el genoma humano, los picos que se detecten y anotadas, en el más genes a fin de identificar RBP2 regiones enriquecidas. (P5) Los resultados se obtienen que muestran las funciones moleculares asociados con RBP2 genes diana sobre la base de todo el genoma de identificación de RBP2 regiones enriquecidas. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Comprobar los resultados de la cromatina sonicación Para comprobar el tamaño de los fragmentos de ADN producidos por el procedimiento de ultrasonidos, 5 g (1 / 10) de la muestra de entrada purificada fue cargado en un 1,8% en gel de agarosa. Como era de esperar, nuestro proceso de sonicación produjo fragmentos en el rango de 150-350 pb. Sin embargo, si los fragmentos no están en este rango, el procedimiento de ultrasonidos debe ajustarse en consecuencia, variando el número de explosiones y la amplitud. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Purificación en gel de los productos amplificados. Los productos de PCR se ejecutan en un gel para eliminar los adaptadores y seleccione un tamaño de gama de plantillas para la generación de plataformas de cluster. Este gel muestra que los fragmentos en el rango entre 150 y 350 pares de bases se produjeron. Que representan fragmentos de ADN genómico de entre 50 y 250 pares de bases de longitud y un adaptador. Estamos sujetos a impuestos especiales de la región seleccionada de gel con un bisturí. Se debe tener cuidado para evitar que la banda adaptador adaptador, que se cifra en unas 120 pares de bases. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Isoforma de anticuerpos específicos permite distinguir entre las isoformas de grandes y pequeños de RBP2. RBP2 estructura de la proteína se presenta en el punto de vista del dominio. RBP2 contiene varios dominios: el catalizador histona desmetilación JmjC dominio y asociados JmjN de dominio, un dominio de ÁRIDAS capaz de secuencia específica de unión al ADN, un dedo de zinc C5HC2 que potencialmente pueden interactuar con el ADN o las proteínas, y varios dominios PHD. Los dos anticuerpos anti-RBP2 que permiten distinguir entre RBP2 isoformas se obtuvieron en contra de la RBP2 fragmentos indicado por líneas gruesas. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5a.jpg" alt="Figura 5 bis" /> Figura 5a. Resumen de RBP2 regiones de unión a lo largo de los cromosomas y los genes con Ensembl. Coordenadas de Genómica identifica enriquecida RBP2 (todas las isoformas y la isoforma de gran tamaño) se presentan regiones de unión de cromosomas sabio. Occupances de genes Ensembl (versión 54; hg18) en los cromosomas (el cromosoma 10, en esta imagen) se presentan como barras de color negro (arriba). Cada región está representada RBP2 vinculante como una línea vertical, en el panel central muestra todas las isoformas RBP2 regiones de unión en el cromosoma 10, y el panel inferior muestra RBP2 regiones isoforma vinculante grandes. El centro y los paneles inferiores con un resúmen de la superposición y la ocupación específica de RBP2 isoformas en el cromosoma 10. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5b.jpg" alt="Figura 5b" /> Figura 5b. El análisis de enriquecimiento funcional de los genes diana RBP2. Heatmap mostrando FDR corregida de forma significativa (valor de p ≤ 0,05) enriquecido GO categorías de función molecular entre los genes vinculados (más genes de la región de unión RBP2) por RBP2 (isoformas de todos y de gran tamaño). Colores hacia el rojo indican significación estadística alta, color amarillo indica significación estadística baja, y el gris indica que no hay significación estadística. El análisis de enriquecimiento muestra la superposición de funciones específicas y la isoforma molecular de los genes diana RBP2.

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	<li>Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+malignancies+caused+by+dysregulation+of+a+chromatin-binding+PHD+finger.">Haematopoietic malignancies caused by dysregulation of a chromatin-binding PHD finger.</a> Nature. 459 (7248), (2009).</li><li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+pRB+to+the+PHD+protein+RBP2+promotes+cellular+differentiation.">Binding of pRB to the PHD protein RBP2 promotes cellular differentiation.</a> Mol Cell. 18 (6), 623-623 (2005).</li><li>Lopez-Bigas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+the+H3K4+histone+demethylase+RBP2+reveals+a+transcriptional+program+controlling+differentiation.">Genome-wide analysis of the H3K4 histone demethylase RBP2 reveals a transcriptional program controlling differentiation.</a> Mol Cell. 31 (4), 520-520 (2008).</li><li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3K4+demethylases+are+essential+in+development+and+differentiation.">Histone H3K4 demethylases are essential in development and differentiation.</a> Biochem Cell Biol. 85 (4), 435-435 (2007).</li><li>Odom, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors.">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303 (5662), 1378-1378 (2004).</li><li>Guenther, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+chromatin+at+genes+encoding+stem+cell+regulators+in+human+mixed-lineage+leukemia.">Aberrant chromatin at genes encoding stem cell regulators in human mixed-lineage leukemia.</a> Genes Dev. 22 (24), 3403-3403 (2008).</li></ol>

Las diferencias funcionales entre las isoformas RBP2 no se han determinado. Hemos utilizado un enfoque integral para identificar las regiones genómicas obligado por RBP2 isoformas y definir las categorías funcionales que estas regiones representan. Esto se logró por chip-Seq análisis, seguidas de análisis bioinformático de la secuencia obtenida se lee. RBP2 modifica metilado residuos de lisina en las colas de las histonas. Hemos encontrado que RBP2 isoforma grande que contiene el módulo de reconocimiento de las histonas metiladas isoforma pequeña lisina y RBP2 que carecen de este módulo se unen a las diferentes regiones en el genoma humano (Figura 5). Es importante destacar que la isoforma específica de las regiones y las regiones con áreas pertenecen a los genes con diferentes funciones moleculares (Figura 5). Por ejemplo, &quot;la cromatina vinculante&quot; y &quot;factor de transcripción vinculante&quot; se pueden atribuir a los objetivos del gen de la isoforma RBP2 pequeño, pero no de la isoforma RBP2 grandes (Figura 5). Al comparar los genes reales conjuntos generados para todas las isoformas y RBP2 isoforma de gran tamaño (datos no mostrados), también puede definir si la isoforma grande es contratado específicamente a ciertos genes.

Secuencias de ADN de 2006 Illumina, Inc. Todos los derechos reservados. <ul><li> Sol_PCR_1 Secuencia 5&#39;-AAT GAT ACG GCG CAC CAC GAG ATC TAC CTT ACT TCC CAC GAC CTA GCT CTT CCG ATC T-3 &#39; </li><li> Sol_PCR_2 Secuencia 5&#39;-CAA GGC GCA GAA GAC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T-3 &#39; </li></ul>

genome-wide analysis using chip to identify isoform-specific gene targets

El reclutamiento de factores de transcripción y epigenéticas de sus objetivos es un paso clave en su regulación. Un lugar destacado en la contratación son los dominios de la proteína que se unen a determinadas modificaciones de las histonas. Un dominio, es la planta de homeodominio (PHD), que se encuentra en varias proteínas de unión a la cromatina. El factor de RBP2 epigenética tiene múltiples dominios PHD, sin embargo, tienen funciones diferentes (Figura 4). En particular, el C-terminal de dominio PHD, que se encuentra en una fusión RBP2 oncogénico en la leucemia humana, se une a trimetiladas lisina 4 de la histona H3 (H3K4me3) 1. La transcripción que corresponde a la isoforma RBP2 que contiene el PHD C-terminal se acumula durante la diferenciación de promonocítica, el linfoma de origen, las células U937 en monocitos 2. De acuerdo con ambos conjuntos de datos de todo el genoma análisis mostró que en las células U937 diferenciadas, la proteína RBP2 se localiza en regiones genómicas altamente enriquecido para H3K4me3 3. Localización de RBP2 de sus objetivos se correlaciona con una disminución en H3K4me3, debido a la actividad RBP2 desmetilasa histonas y una disminución en la actividad transcripcional. Por el contrario, otros dos doctorados de RBP2 son incapaces de unirse H3K4me3. Cabe destacar que el dominio C-terminal de la PHD RBP2 está ausente en los más pequeños RBP2 isoforma 4. Es concebible que la isoforma pequeña RBP2, que carece de la interacción con H3K4me3, difiere de la isoforma más grande en la localización genómica. La diferencia en la localización genómica de RBP2 isoformas puede dar cuenta de la diversidad observada en RBP2 función. En concreto, RBP2 es un jugador fundamental en la diferenciación celular mediada por la proteína retinoblastoma (pRB). De acuerdo con estos datos, el análisis anterior, todo el genoma, sin distinción entre las isoformas, se identificaron dos grupos distintos de RBP2 genes diana: 1) los genes vinculados por RBP2 de una manera que es independiente de la diferenciación, 2) los genes vinculados por RBP2 en una diferenciación manera dependiente. Para identificar las diferencias en la localización entre las isoformas se realizó en todo el genoma análisis de la ubicación por chip-Seq. El uso de anticuerpos que detectan tanto RBP2 isoformas se han localizado todos los RBP2 objetivos. Además tenemos los anticuerpos que se unen sólo grandes y pequeños no RBP2 isoforma (Figura 4). Después de identificar los objetivos de la isoforma grandes, uno se puede quitar de todos los RBP2 objetivos para revelar los objetivos de la isoforma pequeña. Estos datos muestran la contribución de la cromatina, la interacción de dominio en el reclutamiento de proteínas para sus sitios de unión en el genoma.

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Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Aquí estamos presentando una inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) Procedimiento para el análisis de localización en todo el genoma de las isoformas de la proteína que se diferencian en un dominio de unión a las histonas. Estamos aplicando a CHIP-Seq análisis para identificar los objetivos de la histona desmetilasa KDM5A/JARID1A/RBP2.

Análisis de todo el genoma con chip para identificar objetivos específicos para cada isoforma Gene

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

genome-wide-analysis-using-chip-to-identify-isoform-specific-gene

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K vistas.  University of Illinois Chicago - UIC. Aquí estamos presentando una inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) Procedimiento para el análisis de localización en todo el genoma de las isoformas de la proteína que se diferencian en un dominio de unión a las histonas. Estamos aplicando a CHIP-Seq análisis para identificar los objetivos de la histona desmetilasa KDM5A/JARID1A/RBP2.

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Gen bacteriano y Análisis de Expresión El uso de microarrays

Investigación

Biología

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

Todo el genoma análisis de Aminoacilación (de carga) Niveles de tRNA utilizando microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

Genoma toda la pantalla de los genes miARN objetivos mediante el objetivo de la misión Carnet de identificación

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Cuantitativos y automatizada de alto rendimiento del genoma completo de RNAi pantallas en C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

Un bayesiano novela Cambio de punto Algoritmo para el Genoma en todo el análisis de diversos tipos de datos ChIPseq

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genoma escala supresiones de genes en<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de alto rendimiento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polisoma Fraccionamiento y análisis de los mamíferos Translatomes en un genoma de gran escala

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of limited use in exploring bacterial two component regulatory systems with uncharacterized activation conditions. Such systems regulate transcription only when activated in the presence of unique signals. Since these signals are often unknown, the in vitro microarray based method described in this video article can be used to determine gene targets and binding sites for response regulators. This DNA-affinity-purified-chip method may be used for any purified regulator in any organism with a sequenced genome. The protocol involves allowing the purified tagged protein to bind to sheared genomic DNA and then affinity purifying the protein-bound DNA, followed by fluorescent labeling of the DNA and hybridization to a custom tiling array. Preceding steps that may be used to optimize the assay for specific regulators are also described. The peaks generated by the array data analysis are used to predict binding site motifs, which are then experimentally validated. The motif predictions can be further used to determine gene targets of orthologous response regulators in closely related species. We demonstrate the applicability of this method by determining the gene targets and binding site motifs and thus predicting the function for a sigma54-dependent response regulator DVU3023 in the environmental bacterium Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

This video article describes an in vitro microarray based method to determine the gene targets and binding sites for two component system response regulators.

Purificado de ADN afinidad Chip (DAP-chip) Método para determinar los objetivos de genes para bacteriana Dos Sistemas Regulatorios componentes

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).