이 작품은 NIH에서 115,347 - RSG - 08-271 - 01 - GMC ACS에서, 그리고 CA138631에 의해 부여에 의해 지원되었다.

프로토콜은 원래 B. 랜, 2001 적응했다. 그것은 오돔 외하여 프로토콜의 약간의 수정을 나타냅니다.에서 찾을 수 있습니다 5 <a href="http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads">http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads</a> 1. 사전 차단하고 자석 구슬에 항체의 바인딩은 (다음 단계 전에 밤에 수행되어야 함) <ol><li> 신선한 BSA / PBS 용액 (50 MG 10 ML에 BSA PBS -이 솔루션은 한 주일 동안 지속됩니다.) 1 ML에 Dynabeads 단백질 G 100 μL를 (IP 당 여러 개의 IP에 대해 결합) 와시 </li><li> 자기 스탠드를 사용하여 비즈를 수집하고 세척 절차를 두 번 더 반복합니다. </li><li> 다음 PBS / BSA 솔루션 비즈 슬러리 (IP 당) 250 μl에 항체의 10 μg을 추가하고 4 회전 플랫폼에서 밤새 품어 ° C. </li><li> 완료되면, PBS / BSA 용액 1 ML의 비즈 세 번 세척 후 PBS / BSA 솔루션 (IP 당) 10 μl에 resuspend. </li></ol> 2. 셀 교차 연결 <ol><li> 이 절차를 시작하려면 약 10 8 각 immunoprecipitation에 대한 세포, 또는 IP를 성장. 여기, 확산 조직 구 림프종 U937 세포가 사용하고 96시간에 대한 TPA와 monocytic 차별 화를위한 유도하고 있습니다. </li><li> 세포의 성장에 따라, 1 %의 최종 농도 미디어에 직접 포름 알데히드 용액을 추가합니다. 그렇다면 그들이 10 분 동안 상온에서 앉아 소용돌이 flasks의 간략하고하실 수 있습니다. 그런 다음, 미디어를 기음과 얼음처럼 차가운 PBS의 15 ML로 세포를 씻어. 한번 세척을 반복합니다. </li><li> 다음 각 용해 완충액 1 6 ML (50 MM HEPES - 코, 산도 7.5, 140 MM NaCl, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 % 글리세롤을 0.5 % NP - 40, 0.25 % 트리톤 프로 테아제 억제제를 포함하는 X - 100) 추가 얼음 flasks니다. 그런 다음, 4 20 분 동안 flasks 문제를 일으키고 ° C. </li><li> 마지막으로, 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확 15 ML 원뿔 튜브에게 전송할 수 있습니다. 이 시점에서 전지는 -80 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li></ol> 3. 셀 Sonication <ol><li> 세포가 얼어있다면, 그들을 좀 녹여. 일단 해동, 4에서 10 분 동안 3,000 rpm으로 세포를 스핀 다운 ° C 및 뜨는 폐기하십시오. 그런 다음, 용해 완충액 2 (10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 200 MM NaCl, 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.5 MM EGTA, 프로 테아제 억제제를 포함) 6 ML의 세포를 resuspend. 10 분 실온에서 부드럽게 튜브를 록. </li><li> 원심 분리를 반복하고 용해 완충액 3 (프로 테아제 억제제를 포함하는 10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 100 MM NaCl, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.5 MM EGTA, 0.1 %의 나트륨 deoxycholate, 0.5 % N - lauroylsarcosine) 2.5 ML에있는 세포를 resuspend . </li><li> 다음, 50 및 60 %의 진폭 사이로 설정 브랜슨 450 Sonifier의 microtip과 얼음 물을 비커에 배치하여 sonication에 대한 중지를 준비합니다. </li><li> 1 분 얼음 30초 지속 버스트 및 냉각을위한 솔루션을 Sonicate. 이러한 펄스에게 10-15 회 반복합니다. 그런 다음 튜브의 내용을 피펫 아래 새로운 튜브로 전송할 수 있습니다. 추가 5 번 파동과 솔루션을 냉각 계속합니다. </li><li> sonication에 따라 10 %를 추가 트리톤 X - 100 솔루션 볼륨의 1 / 10. 1.5 ML의 원심 분리기 튜브에 lysates을 전송하고, microcentrifuge에 파편을 스핀. 그런 다음 새로운 튜브에 세포 lysate를 전송할 수 있습니다. </li></ol> 4. 염색질 Immunoprecipitation <ol><li> 이전 염색질의 immunoprecipitation, 또는 칩을, 입력 샘플로 세포 lysate 50 μL를 저장합니다. 그런 다음, Dynabeads 위에서 설명한대로 이전에 작성되었습니다 항체 사전 바운드로 허가 세포 lysate를 결합. 4 ° C 하룻밤에, 50 μL 입력 샘플 이외에, 혼합 록. </li><li> 와시 버퍼 1 ML (50 MM HEPES - 코, 산도 7.6, 0.5 M LiCl, 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.7 %의 나트륨 deoxycholate, 1 % NP - 40)와 비즈를 씻으십시오. 그런 다음, 비즈를 수집하고 뜨는을 제거하는 자기 스탠드를 사용합니다. 이 씻어에게 6-8 번 반복합니다. </li><li> 와 최종 세척을 수행 한 ML TE - 플러스 - 50 MM NaCl (10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 50 MM NaCl, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)). 4 2 분 동안 3,000 rpm으로 microcentrifuge에 비즈를 스핀 ° C. 원심 분리 후, 잔여 TE 버퍼를 대기음. </li><li> 그런 다음 샘플에 용출 버퍼 100 μL (50 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % SDS)을 추가합니다. 즉시, 65에서 샘플을 품어 ° C 10~15분하십시오. 정지에있는 구슬을 유지 1.5 ML 튜브 랙마다 이분에 대한 튜브를 스크래치. </li><li> 원심 분리와 자기 스탠드를 사용하여 비즈를 수집하고, PCR 튜브에 뜨는을 전송하기만하면됩니다. 그런 다음 이전에 저장한 입력 샘플을 검색하고 용출 버퍼 3 볼륨을 추가합니다. </li><li> 마지막으로, 65에서 야간 열 자전거 타는 사람에 IP 및 입력 샘플을 배치 ° C를상호 연계를 반대. </li><li> 다음날, 샘플로 TE 버퍼 1 볼륨을 추가합니다. 그런 다음, 0.2 μg / μL의 최종 농도에 RNase A를 추가합니다. 37 1~2시간에 대한 열 자전거 타는 사람의 표본을 품어 ° C. </li><li> 부화 후 0.2 μg / μL의 최종 농도의 proteinase K를 추가합니다. 그런 다음 2 시간 동안 55 ° C에서 열 자전거 타는 사람에 샘플을 품어. </li><li> 다음으로, 페놀 중 하나 볼륨 번 샘플을 추출합니다. 클로로포름 : isoamyl 알콜 페놀 중 하나 볼륨 샘플 잠시 시간을 추출합니다. isoamyl 알콜 : 마지막으로, 클로로포름 중 하나 볼륨 한번 더 샘플을 추출합니다. </li><li> 그런 다음, 각 샘플에 글리코겐의 30 μg를 추가합니다. 또한, 샘플로 에탄올의 0.2 몰라 두 볼륨의 최종 농도에 NaCl을 추가합니다. -80시 30 분 그들을 품어 ° C. 부화 후 샘플을 회전하고 뜨는을 가만히 따르다. 75 % 에탄올 500 μL로 알약을 씻으십시오. 그런 다음 알약을 건조하고는 물 40 μL에 다시 일시 중지합니다. </li><li> sonication 절차에 의해 만들어진 DNA 조각의 크기를 확인하려면, 1.8 % 아가로 오스 겔의 정화 입력 샘플의 5 μg를로드하고 젤을 실행합니다. sonication 절차는 150-350 기본 쌍 범위의 조각을 제작해야합니다. 조각이 범위에 빠지지하지 않은 경우 단, sonication 절차는 파열과 진폭의 수를 변화에 의해 조정되어야합니다. </li><li> 1 IP 샘플 μl 및 입력 샘플의 희석 일련의 유전자 특정 PCR을 수행하여 제어 바인딩을 지역에서 농축을 칩 견고하고 특이성을 확인하려면 다음과 같이하십시오. 두 세 &quot;바운드&quot;지역과 언바운드 컨트롤 지역 IP를 입력 샘플의 품질을 테스트하기 위해 선택해야합니다. </li></ol> 5. 게놈 DNA의 증폭 <ol><li> IP 샘플 또는 입력 샘플 200 NG 34 μl를 시작으로, 최종 수리, 게놈 DNA 샘플 준비 키트를 사용 DNA 조각을 &#39;A&#39;꼬리 추가 및 어댑터의 결합 수행 <a href="http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn">http://www.illumina.com/systems/을 genome_analyzer.ilmn</a> (Illumina, 주식 회사, 샌디에고, CA). </li><li> MinElute PCR의 정제 키트를 사용하여 DNA를 정화하고 50 ° C. 미리 예열되었음을 버퍼 EB (10 MM Club 호텔 트리스, 산도 8.5)에 elute 예를 들어, 각각, IP 및 입력 DNA 샘플의 최종 용리 23 μL와 46 μL를 사용합니다. </li><li> 20 μm의 Sol_PCR_2의 μL 어댑터와 함께 DNA 23 μL를 사용하여 PCR 반응 및 키트 25 μL Phusion DNA의 효소, 20 μm의 Sol_PCR_1 1 μL, 1을 확인하십시오. 다음과 같이 PCR 반응을 실행 2) 10초 98시 ° C, 3) 65 ° C에서 30초; ° C 98 1) 30 초 4) 30 초 72의 ° C, 반복 단계 단계 2-4 18 72에서 시간과 다음 오분 ° C가 드디어 4 ° C. 개최를 </li><li> PCR 증폭에 따라, QIAGEN MinElute PCR의 정제 키트와 함께 DNA 정화. 50 버퍼 EB 사전 따뜻한 15 μL는 ° C와 DNA를 elute. 샘플 1시 4분 0.5 μL를 희석하고 Nanodrop 읽기를 수행합니다. </li></ol> 6. 증폭 제품의 젤 정화 <ol><li> 증폭 제품을 정화, HPLC 등급 물을 사용하여 50 ML의 1.8 % 아가로 오스 겔을 준비합니다. 아가로 오스가 녹은 후 태와 ethidium의 브로마이드를 추가합니다. 그런 다음 젤을 따라줘. 입력 및 IP 샘플을 로딩 버퍼 4 μL를 추가한 후 겔을로드합니다. 그런 다음, 45 분 120 볼트에서 젤을 실행합니다. </li><li> 그것이 실행 후 젤 분석. 젤 150 사이 350 기본 쌍이 ​​생산 범위에 조각을 공개해야합니다. 그들은 길이와 어댑터에서 50 250 기본 쌍 사이의 게놈의 DNA 조각을 나타냅니다. </li><li> 메스로 150 350 기본 쌍 범위에서 자료를 포함하는 젤의 엑사이스 지역. 어댑터 - 어댑터 밴드를 절개하지 않도록 몸조심, 이것은 약 12​​0 기본 쌍에서 실행됩니다. 제조 업체의 지침에 따라 QIAquick 젤 추출 키트를 사용하여 DNA를 복구합니다. 특히, 400 밀리그램 이하의 젤 슬라이스에 대한 QIAquick 젤 추출 키트에서 한 컬럼을 사용합니다. 추출 과정을 시작하려면, 젤 1 볼륨에 버퍼를 QG 3 볼륨을 추가합니다. 이소프로판올 1 볼륨을 추가하고 열에 혼합물을로드합니다. 열을 씻어 QG 0.5 ML를 사용 키트 설명서에 설명된 표준 절차에 의해 따랐다. H 2 O를 사용하여 미리 예열 50 ° C DNA를 elute 수 있습니다. 37 5 분 H 2 O 30 μl로 컬럼을 품어 ° C 내려 회전하기 전에. </li><li> 가열하지 않고 Speed​​vac에서 정확하게 11 μL로 샘플을 건조시킵니다. 샘플 1 μL를 제거하고 Nanodrop 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다. </li><li> 마지막으로, 같이에서 설명 Illumina 게놈 AnalyzerIIe 사용하여 농축 유전자 제품 식별 <a href="http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf">http://genesdev.cshlp.org/content/suppl을</a>/ 2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf 6. </li></ol> 7. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 다음과 같은 실험의 전반적인 목표는 KDM5A/JARID1A/RBP2 히스톤 demethylase의 게놈 목표를 식별하는 것입니다. (P1)이 적절한 크기의 DNA 조각을 만들어 sonicated됩니다 교차 연결된 염색질의 준비에 의해 이루어진다. (P2) 두 번째 단계로서, RBP2 바운드 DNA 조각은 RBP2 항체와 immunoprecipitated 있습니다. (P3) 다음, 복구 DNA 조각은 끝에 수리하고 어댑터 Illumina 클러스터 역의 흐름 세포에 대한 분석을 위해 게놈 DNA의 라이브러리를 준비하는 게놈 DNA의 끝부분에 출혈도 잡았 있습니다. DNA 라이브러리는 사이클의 낮은 번호를 사용하여 PCR로 증폭됩니다. (P4) 마지막으로, illumina 합성 짧은 고유 인간 게놈에 정렬됩니다 읽고, 중요한 봉우리는 RBP2 풍부한 지역을 파악하기 위해 식별과 가장 가까운 유전자에 주석 있습니다. (P5) 결과는 RBP2 풍부한 지역의 게놈 전체의 신분에 따라 RBP2 대상 유전자와 연관된 분자 기능을 보여줄 것을 얻을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. sonication 절차에 의해 만들어진 DNA 조각의 크기를 확인하려면 염색질 sonication의 결과를 확인, 정화 입력 샘플 5 μg (1 / 10) 1.8 % 아가로 오스 겔에 적재가되었던 것. 예상했던대로, 우리 so​​nication 절차 150-350 BP의 범위에서 조각을 생산. 조각이 범위에 빠지지하지 않은 경우 단, sonication 절차는 파열과 진폭의 수를 변화에 의해 적절하게 조정해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 증폭 제품의 젤 정화가. PCR 제품은 어댑터를 제거하고 클러스터 세대 플랫폼에 템플릿의 크기 범위를 선택하는 젤에서 실행됩니다. 이 젤 150 및 350 기본 쌍 사이의 범위에서 조각이 생성 것을 나타냅니다. 그들은 길이와 어댑터에서 50 250 기본 쌍 사이의 게놈의 DNA 조각을 나타냅니다. 메스로 젤의 우리는 소비세 선택한 영역. 치료는 약 12​​0 기본 쌍에서 실행 어댑터 어댑터 밴드를 피하기 위해 이동해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 이소형 특정 항체는 RBP2의 크고 작은 isoforms 구별하실 수 있습니다. RBP2 단백질 구조가 도메인보기에 표시됩니다. 촉매 히스톤 demethylation JmjC 도메인과 관련된 JmjN 도메인 시퀀스 특정 DNA 바인딩, 잠재적으로 DNA 또는 기타 단백질, 여러 박사 도메인과 상호 작용 수있는 C5HC2 아연 손가락 가능한 건조한 도메인 : RBP2 여러 도메인을 포함하고 있습니다. RBP2 isoforms 구별 수 있도록 두 가지 안티 RBP2 항체는 굵은 선으로 표시된 RBP2 조각에 대한 파생되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5a.jpg" alt="그림 5A" /> 그림 5A. 염색체와 유전자 Ensembl와 함께 RBP2 바인딩 지역의 개요. 확인된 풍부한 RBP2의 게놈 좌표가 (모든 isoforms 및 대형 이소형) 바인딩 지역 염색체가 현명 제공됩니다. Ensembl 유전자의 Occupances (버전 54, hg18) 염색체에있는가 (이 그림에서 염색체 10) 검은 바 (맨 위 패널)로 제공됩니다. 각 RBP2 바인딩 지역은 중앙 패널은 모든 RBP2 isoforms에게 염색체 10 일 구속 지역을 표시하는 수직선,로 표시하고, 하단 패널 RBP2 대형 이소형 바인딩 영역을 표시합니다. 중간과 하단 패널은 중복의 개요 및 염색체 10 RBP2 isoforms의 특정 숙박을 제공합니다. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5b.jpg" alt="그림 5B" /> 그림 5B. RBP2 대상 유전자의 기능 강화 분석. 히트맵 FDR을 보여주는 풍부한는 RBP2 (모든 대형 isoforms)의 (RBP2 바인딩 영역에 유전자를 가장 가까운) 바운드 유전자 간의 분자 기능 범주를 GO (P - 값 ≤ 0.05) 대폭 수정. 붉은 방향으로 색상이 높은 통계 중요성을 나타내는 노란색이 낮은 통계 중요성을 나타냅니다, 그리고 회색은 통계 중요성을 나타냅니다 없습니다. 농축 분석 RBP2 대상 유전자의 중복과 이소형 특정 분자 기능을 보여줍니다.

<ol>
	<li>Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+malignancies+caused+by+dysregulation+of+a+chromatin-binding+PHD+finger.">Haematopoietic malignancies caused by dysregulation of a chromatin-binding PHD finger.</a> Nature. 459 (7248), (2009).</li><li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+pRB+to+the+PHD+protein+RBP2+promotes+cellular+differentiation.">Binding of pRB to the PHD protein RBP2 promotes cellular differentiation.</a> Mol Cell. 18 (6), 623-623 (2005).</li><li>Lopez-Bigas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+the+H3K4+histone+demethylase+RBP2+reveals+a+transcriptional+program+controlling+differentiation.">Genome-wide analysis of the H3K4 histone demethylase RBP2 reveals a transcriptional program controlling differentiation.</a> Mol Cell. 31 (4), 520-520 (2008).</li><li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3K4+demethylases+are+essential+in+development+and+differentiation.">Histone H3K4 demethylases are essential in development and differentiation.</a> Biochem Cell Biol. 85 (4), 435-435 (2007).</li><li>Odom, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors.">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303 (5662), 1378-1378 (2004).</li><li>Guenther, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+chromatin+at+genes+encoding+stem+cell+regulators+in+human+mixed-lineage+leukemia.">Aberrant chromatin at genes encoding stem cell regulators in human mixed-lineage leukemia.</a> Genes Dev. 22 (24), 3403-3403 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

RBP2 isoforms 사이의 기능적 차이는 결정되지 않았습니다. 우리는 RBP2 isoforms에 의해 바운드 게놈 영역을 파악하고이 지역이 대표하는 기능 범주를 정의하는 종합적인 접근 방식을 사용했습니다. 이것은 얻은 일련의 생물 정보학 분석을 읽은 다음에 칩 Seq 분석에 의해 성취되었다. RBP2는 히스톤 꼬리에 methylated 리신 잔류물을 수정합니다. 우리는 RBP2 큰 이소형은 인간의 게놈 (그림 5A)의 다른 지역이 모듈 바인딩 부족 methylated 히스톤 라이신과 RBP2 작은 이소형에 대한 인식 모듈을 포함하는 것으로 나타났습니다. 중요한 것은, 이소형 특정 지역 및 중복 지역은 다른 분자 기능 (그림 5B)와 유전자에 속합니다. 예를 들어, &quot;염색질 결합&quot;및 &quot;전사 인자 바인딩&quot;기능은 RBP2 작은 이소형의 유전자 표적 관찰 작용의 수 있지만하지 RBP2 대형 이소형 (그림 5B). 실제 유전자를 비교하여 큰 이소형가 특별히 특정 유전자에 모집하는 경우에는 모든 isoforms 및 RBP2 대형 이소형 (데이터가 표시되지 않음)에 대해, 우리도 정의할 수 있습니다 생성 설정합니다.

Oligonucleotide 시퀀스 2,006 Illumina, 주식 회사 모든 권리 보유. <ul><li> Sol_PCR_1 순서 5&#39; - AAT GAT GCG ACG ACC ACC 개그 ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC CTT GCT CCG ATC T - 3 &#39; </li><li> Sol_PCR_2 순서 5&#39; - CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T - 3 &#39; </li></ul>

genome-wide analysis using chip to identify isoform-specific gene targets

자신의 목표를 transcriptional 및 epigenetic 요인 모집들은 규제에서 중요한 단계입니다. 눈에 띄게 특정 히스톤 수정에 바인딩 단백질 도메인은 채용에 등장. 그 중 하나가 도메인을 여러 염색질 결합 단백질에있는 공장 homeodomain (PHD)입니다. epigenetic 계수 RBP2 여러 박사 도메인을 가지고 있지만, 그들은 다른 기능 (그림 4)가. 특히, 인간의 백혈병에 RBP2 종양 발생 융합에있는 C - 터미널 PHD 도메인, 히스톤 H3 (H3K4me3) 1 리신 4 trimethylated에 바인딩합니다. C - 터미널 박사 학위를 포함하는 RBP2의 이소형에 해당하는 성적표는 monocytes이에 promonocytic, 림프종 - 유래, U937 세포의 분화 동안 축적. 데이터의 두 집합과 일치, 게놈 차원의 분석은 차별화된 U937 세포에 RBP2 단백질이 높은 H3K4me3 3에 대한 풍부한 게놈 지역에 현지 도착 것으로 나타났다. 그 목표를 RBP2의 지방화는 RBP2 히스톤 demethylase 활동 및 transcriptional 활동의 감소로 인해 H3K4me3의 감소로 연결합니다. 대조적으로, RBP2의 다른 두 박사 학위가 H3K4me3를 바인딩할 수 없습니다. 특히, RBP2의 C - 터미널 도메인 PHD는 작은 RBP2 이소형 4 결석입니다. 그것은 H3K4me3와 상호 작용을 결여 RBP2,의 작은 이소형가 게놈 위치에 더 큰 이소형 다릅니다 것을 알았기 때문에. RBP2 isoforms의 게놈 위치에 차이는 RBP2 함수에서 관찰된 다양성에 대한 계정 수 있습니다. 특히, RBP2는 retinoblastoma 단백질 (PRB)에 의해 매개 세포 분화에 중요한 선수이다. ;에 RBP2에 의해 바운드 2) 유전자 차별 - 1) 분화의 독립적인 방식으로 RBP2 구속 유전자 : isoforms 사이의 구별없이 이러한 데이터 이전 게놈 차원의 분석과 일치 RBP2 대상 유전자의 서로 다른 두 그룹을 식별 종속 방식. isoforms 사이의 로컬 리 제이션의 차이를 확인하려면 우리는 칩 Seq하여 게놈 차원 위치 분석 수행. 우리 모두가 RBP2 대상을 찾았습니다 모두 RBP2 isoforms을 탐지 항체를 사용하여. 또한 우리는 크고 작은하지 RBP2 이소형 (그림 4) 바인딩 항체 있습니다. 대형 이소형 대상을 식별하는 한, 그 다음 작은 이소형의 목표를 밝혀 모든 RBP2 대상에서 그들을 빼야 수 있습니다. 이러한 데이터는 게놈에서의 바인딩 사이트에 단백질 모집에 염색질 - 상호 작용하는 도메인의 기여를 보여줍니다.

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets at JoVE.com

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

여기서 우리는 히스톤 바인딩 도메인에 차이가 단백질 isoforms의 게놈 차원 위치 분석을 위해 염색질의 immunoprecipitation (칩) 프로 시저를 발표하고 있습니다. 우리는 KDM5A/JARID1A/RBP2 히스톤 demethylase의 목표물을 식별 칩 Seq 분석에 적용됩니다.

이소형 특정 유전자 목표를 식별 칩을 사용하여 게놈 차원의 분석

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

genome-wide-analysis-using-chip-to-identify-isoform-specific-gene

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K 조회수.  University of Illinois Chicago - UIC. 여기서 우리는 히스톤 바인딩 도메인에 차이가 단백질 isoforms의 게놈 차원 위치 분석을 위해 염색질의 immunoprecipitation (칩) 프로 시저를 발표하고 있습니다. 우리는 KDM5A/JARID1A/RBP2 히스톤 demethylase의 목표물을 식별 칩 Seq 분석에 적용됩니다.

비디오: Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Microarrays을 사용하여 세균의 유전자 발현 분석

연구

생물학

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

Microarrays을 사용하여 tRNA의 Aminoacylation (충전) 레벨의 게놈 - 와이드 분석

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

선교 대상 아이디 라이브러리를 사용하여 miRNA 목표를위한 게놈 - 와이드 스크린

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

의 정량 및 자동화된 고속 처리량 게놈 전체의 RNAi 화면 C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

다양한 ChIPseq 데이터 유형의 게놈 차원의 분석을위한 소설 베이지안 변경 - 포인트 알고리즘

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

게놈 전체 유전자 삭제할에<em&gt; 연쇄상 구균 sanguinis</em&gt; 높은 처리량 PCR에 의한

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

게놈 전체 규모에 Polysom​​e 분별과 포유류 Translatomes 분석

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of limited use in exploring bacterial two component regulatory systems with uncharacterized activation conditions. Such systems regulate transcription only when activated in the presence of unique signals. Since these signals are often unknown, the in vitro microarray based method described in this video article can be used to determine gene targets and binding sites for response regulators. This DNA-affinity-purified-chip method may be used for any purified regulator in any organism with a sequenced genome. The protocol involves allowing the purified tagged protein to bind to sheared genomic DNA and then affinity purifying the protein-bound DNA, followed by fluorescent labeling of the DNA and hybridization to a custom tiling array. Preceding steps that may be used to optimize the assay for specific regulators are also described. The peaks generated by the array data analysis are used to predict binding site motifs, which are then experimentally validated. The motif predictions can be further used to determine gene targets of orthologous response regulators in closely related species. We demonstrate the applicability of this method by determining the gene targets and binding site motifs and thus predicting the function for a sigma54-dependent response regulator DVU3023 in the environmental bacterium Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

This video article describes an in vitro microarray based method to determine the gene targets and binding sites for two component system response regulators.

세균에 대한 두 개의 구성 요소 규제 시스템을 유전자 표적을 확인하는 DNA 친화력 - 정제 칩 (DAP-칩) 방법

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).