Los autores agradecen al H. Eisen, Gubbels M., K. van Grinsven, Guillén E., A. Drake, V. Mahajan, Gao P. y G. Yap para un debate fructífero y reactivos. Agradecemos a J. Dausman, Flannery R., y J. Jackson para obtener ayuda con la gestión de la colonia de ratones. Agradecemos a P. Wisniewski para FACSorting. EMF fue apoyada por el Programa de Ciencias de Fronteras Humanas. RJ fue apoyada por el Instituto Nacional de Salud subvenciones RO1-HD045022 y R37 CA084198. HLP fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Salud.

Este método se utilizó en la investigación publicada en <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/328/5975/243">Kirak et al., Science 328 (5975), desde 243 hasta 248 (2010)</a> . 1. El aislamiento de las células del donante Antes de T específicos o de células B se puede utilizar como donantes de células para generar modelos de transnuclear ratón, ratones necesidad de estar infectados con un patógeno de interés o inmunizados con un antígeno de interés. Puesto que hemos utilizado las células CD8 + específicas para Toxoplasma gondii, el siguiente protocolo se describe la generación y el aislamiento de estas células y tiene que adaptarse de acuerdo al interés personal. <ol><li> Quistes derivados de un homogeneizado de cerebro de ratón (40) se inyectan intraperitonealmente en BL / 6 x Balb / c F1 (B6CF1) ratones, lo que permite el aislamiento de H-2 b y H-2 d restringido células T CD8 +. </li><li> En el pico de la respuesta inmune, el ratón infectado es la eutanasia, el bazo aisladas y se coloca en un plato con 6 ml de células rojas de la sangre (glóbulos rojos) de tampón de lisis. </li><li> Utilizando los lados mate de dos diapositivas de cobertura, el bazo es cuidadosamente suelo y se incubaron en el buffer de lisis durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 14 ml de PBS, filtrar la suspensión de células a través de un colador de células (40 o 70 micras) en un tubo Falcon de 50 ml y centrifugar durante 5 minutos a 300 gramos. </li><li> Extraer el sobrenadante, resuspender el botón celular en 1 ml de PBS y la transferencia en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Centrifugar durante 5 minutos a 300g y eliminar el sobrenadante después. </li><li> Resuspender el botón celular en 50 l de PBS, añadir anticuerpos marcados con fluorescencia para identificar el tipo de células de interés (por ejemplo, CD3, B220, CD8 y CD4), y marcados con fluorescencia tetrámero MHC-I (MHC-II tetrámero de las células T CD4) que se carga con el péptido de interés para la suspensión de células y se incuba durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Añadir 1 ml de PBS, centrifugar durante 5 min a 300 g de pellets, resuspender en 3 ml de PBS, y el filtro de la suspensión celular a través de un colador de células (40 o 70 micras) en un tubo. </li><li> FACSorting realizar mediante el establecimiento de las puertas de la estricta (fig. 1B). </li></ol> 2. Transferencia nuclear de células somáticas Hay algunos protocolos para la transferencia nuclear de células somáticas. El que se describe aquí hace uso de ovocitos detenidos en metafase II y la inhibición de la segunda división meiótica con citocalasina B. Por lo tanto, las células del donante son necesarios que se encuentran en la fase G0/G1. <ol><li> Preparación de los ovocitos <ol><li> Los ratones hembra de BDF1 fondo se inyectan intraperitonealmente con 5IU PMS por ratón 17:00-19:00. </li><li> Alrededor de 47 horas más tarde, cada ratón se inyecta intraperitonealmente con 5IU HCG. </li><li> Prepare una placa de cultivo (KSOM-AA petróleo cae por debajo) de los ovocitos en el mismo día de la inyección de hCG y se colocan en una incubadora 37 ° C, 5% de CO 2. Además, preparan las agujas necesarias para la SCNT (7μm de enucleación y 4 o 5μm para la transferencia nuclear de los núcleos de linfocitos) cargándolos con mercurio. </li><li> La eutanasia a los ratones y aislar a los oviductos de 13h después de HCG (aproximadamente las 8 AM). Recoge los oviductos en 1-2 gotas de HCZB. </li><li> Uno por uno, los oviductos se mueven en un desplegable que contiene M2 w / hialuronidasa. Nick el oviducto cuidadosamente con una pinza y mover el ovocito-cumulus-compleja en la caída. Después de todo ovocitos cumulus-complejos se han aislado, el plato se incuba a 37 ° C. </li><li> Después de 2-5 minutos (el tiempo exacto depende de la hornada de hialuronidasa) recoger los ovocitos, lávate en HCZB y la placa que en KSOM-AA gotas. </li></ol></li><li> Enucleación de ovocitos <ol><li> Use la tapa de una caja de Petri para preparar el plato SCNT. Configurar el microscopio, y el micromanipulador. </li><li> Lave la aguja enucleación (7 m) en PVP antes de comenzar con la enucleación. </li><li> De enucleación, colocar un grupo de ovocitos (10-30) en una gota de HZCB con citocalasina B (5 mg / mL). Mientras se incuba (min. 5 minutos) hasta la línea de los ovocitos en posición horizontal. </li><li> Tome un ovocito y lo coloca en frente de la aguja de la celebración. Fijar el ovocito de la celebración de la aguja mediante la aplicación de un vacío. Con la aguja de la enucleación, a su vez el ovocito hasta que el cromosoma eje del complejo (CSC, a menudo llamado el &quot;núcleo&quot;) se encuentra en la posición de las 3. </li><li> Utilizando piezo-pulso penetrar la zona pelúcida con cuidado, sin dañar el óvulo. Lugar la apertura de la aguja al lado del eje de la metafase II y aplicar vacío. El &quot;núcleo&quot; debe moverse lentamente hacia la aguja, y la membrana se debe sellar una vez que se elimina por completo. </li><li> La transferencia de los ovocitos enucleados de nuevo en las gotas KSOM-AA, y lavarlos varias veces. Repita el correomedidas de nucleación con un nuevo grupo de ovocitos. Continúe hasta que todos los huevos se enucleado o hasta unos 11. </li></ol></li><li> Transferencia nuclear <ol><li> Para la transferencia nuclear, el intercambio de la aguja de la enucleación (7 m) con una aguja de transferencia nuclear (4 o 5 m) y se lava con PVP. </li><li> Lugar a las células de interés (por ejemplo, las células CD8 + T) en una gota de PVP, mezclar bien e incubar durante un mínimo de 10 min. </li><li> Lugar a un grupo de ovocitos enucleados (10-30) en una gota de HCZB con citocalasina B (2,5 mg / mL). Mientras se incuba (min. 5 min) línea de ovocitos horizontal mediante el uso de la aguja de transferencia nuclear. </li><li> Recoger una célula donante de la suspensión de PVP-célula y aspirado que dentro y fuera, hasta que la membrana externa se ha roto (fragmentos de la membrana y el citosol debe ser visible). Si es necesario un piezo-pulso se puede aplicar. Una vez que el núcleo ha sido aislado, moverlo un poco en la aguja, y continuar a recoger a los núcleos hasta que tenga 10 a 30. </li><li> Mover a la caída que contienen los ovocitos enucleados alineados. Fijar un ovocito para la celebración de la aguja mediante la aplicación de vacío. Coloque la aguja de transferencia nuclear (el núcleo debe estar lejos de la apertura), adyacente a la zona pelúcida y aplicar piezo-pulso hasta que la aguja ha atravesado la zona pelúcida. Cuidadosamente el movimiento de un núcleo a la punta de la aguja, introduzca la aguja en el óvulo hasta que la punta de la aguja es de 2 / 3 en el interior. Aplique una pequeña presión negativa, de modo que un poco de la membrana del ovocito está en la aguja. </li><li> El siguiente paso es muy importante, ya que es la única vez que el ovocito es en realidad &quot;abierta&quot;. Aplicar un pulso de piezo, empuje el núcleo de la aguja mediante la aplicación de presión positiva, cuidadosamente retire la aguja de modo que la punta es aproximadamente 1 / 3 en el ovocito, y luego aplicar presión negativa y siguen a retirar la aguja sellar el ovocito. Repita este paso con cada ovocito. </li><li> Después de todos los ovocitos de un grupo han recibido un núcleo, se lavan y se cultivan en KSOM-AA medios de comunicación. Repita este procedimiento con todos los ovocitos. </li><li> Después de que el último grupo ha sido en las culturas KSOM-AA por un mínimo de 30 minutos, la SCNT-embriones son transferidos en forma de gotas de los medios de activación de Ca-libre que contiene SrCl2. </li><li> Después de 6 horas de la activación, la cantidad de pseudo-pronúcleos (PPN)-positivos SCNT-embriones se determina. Los embriones se lavan y se cultivaron en KSOM-AA gotas de otros 3,5 días hasta que han llegado a la etapa de blastocisto. </li><li> Drogas o productos químicos de la elección (por ejemplo, tricostatina A) se puede agregar a la activación y medios de cultivo. </li></ol></li></ol> 3.Derivation de células madre embrionarias Los blastocistos SCNT, se puede utilizar a cualquiera de ellos en la transferencia de pseudo-embarazadas las mujeres (también conocida como clonación directa o un paso) o para obtener células madre embrionarias (también conocida como clonación indirecta o de dos). Ya que es mucho más eficiente para generar células madre embrionarias, se elige el procedimiento de dos pasos. En caso de que el científico está interesado en la clonación directa, los blastocitos se pueden transferir directamente a las mujeres embarazadas pseudo-como se describe en la sección 5. Existen muchos protocolos que describen la obtención de células madre embrionarias. El que se describe aquí es una técnica estándar, que utiliza células alimentadoras, y suero fetal bovino. <ol><li> El segundo día después de la transferencia nuclear, preparar una placa de 96-U-y para la derivación de células ES. </li><li> Añadir 100 ml de gelatina en cada pocillo de una placa de 96 U, bueno, se incuba durante un mínimo de 10 minutos y retirarla después. </li><li> Descongelar las células de alimentación y resuspender en un volumen de medio de la EDS de acuerdo, por ejemplo células de alimentación equivale a un área de 25 cm 2 se resuspenden en 10 ml de medio EDS y 200 l de la suspensión celular, se añade en cada una de las de gelatina bien tratados. </li><li> Colocar la placa en una incubadora y la cultura a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Después de 3,5 días, los embriones debe estar en el estadio de blastocisto. </li><li> Preparar un plato de bacterias en placas estériles ES un medio de unas gotas de células y thyrode ácido. </li><li> Los blastocistos se transfieren primero de las gotas KSOM-AA en gotas que contienen medio normal de las células ES y lavado dos veces. </li><li> Con cuidado, la transferencia de un grupo de blastocistos (blastocistos 5-10) en una gota de ácido thyrode y mantenerse en ella hasta la zona pelúcida se haya disuelto. </li><li> Los blastocistos se transfieren a una caída con el medio ES, se lavaron dos veces, y luego se colocan en el alimentador recubiertos de 96 U y placa (un blastocisto en un pozo). </li><li> Los embriones son cultivados durante 5-7 días en una incubadora a 37 ° C CO, 5% 2 sin molestarlos. Esto permite que el embrión de unattach a la capa de alimentación, y para formar una consecuencia. </li><li> Prepare 24 y placas, por sistemas de siembra en medio de la EDS en cada pozo, por ejemplo, volver a suspender el equivalente de 50 cm 2 de alimentación en 12 ml de medio ESD, y añadir 500 l de la suspensión celular en cada pocillo. </li><li> Retire con cuidado el medio de la EDS de la placa de 96-U-bien con los embriones, lave cada pocillo dos veces con 250 l Hepes (o PBS), se añaden 50 l de tripsina y se incuba durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Pipeta hacia arriba y abajo varias veces, hasta que fruto se ha derrumbado en una suspensión de una sola célula, el traslado en una placa de 24 pocillos y se incuba a 37 ° C CO, 5% 2. </li><li> Si la derivación de ESC fue un éxito, las colonias de ESC debe ser visible después de 7-10 días. </li></ol> 4.Blastocyst inyección La inyección de blastocistos es una técnica de rutina para generar cualquier tipo de modelo de ratón transgénico. Es importante mencionar que la inyección de blastocistos y el posterior traslado en pseudo-embarazadas las mujeres tiene que ser oportuna. <ol><li> Primer ratones hembra con el síndrome premenstrual y HCG como se describe en la sección 2.1. Después de la inyección de HCG poner los ratones hembra con ratones macho (una hembra y un ratón macho por jaula). </li><li> Al día siguiente, marque las mujeres para los enchufes. Esto se cuenta como 0.5dpc (días después del coito). </li><li> Embriones fecundados se aisló del oviducto como se describe en la sección 2.1, y se cultivan en KSOM-AA durante 3 días. </li><li> Prepare las células ES en el día de la inyección de blastocisto (3.5dpc). </li><li> Quitar medio de células madre embrionarias, lavar dos veces con Hepes (o PBS), agregar la tripsina y se incuba durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Resuspender trypsinized células con medio de ES, la placa en un plato, y se incuba durante 45-60 min a 37 ° C, 5% de CO 2 para reducir la cantidad de células alimentadoras (células alimentadoras se adhieren más rápido que las células ES). </li><li> Transferir la suspensión celular a través de un colador de células (40 o 70 micras) en un tubo y centrifugar durante 5 min a 1000 rpm. </li><li> Extraer el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 500 l medio ES y almacenar en hielo hasta que se necesite. </li><li> Prepare la tapa de un recipiente estéril de bacterias en forma de gotas que contienen placas PVP y HCZB. </li><li> Prepare una aguja 15 micras por la carga de mercurio, colocándolo en posición y lavarlo con PVP. </li><li> Lugar a un grupo de blastocistos (10-30 blastocistos) en una caída con HCZB, y añadir 5-50 l suspensión de células ES (depende de la concentración) en una gota de HCZB. </li><li> Recoger células madre embrionarias (50-100 células) con la aguja de inyección. </li><li> Mover a la caída de los blastocitos. Alinear los blastocitos en posición horizontal, y fijar una con la aguja de la celebración mediante la aplicación de vacío. </li><li> Con la aguja de la inyección a su vez el blastocisto hasta que la masa celular interna (ICM) se encuentra en la posición de las 9. </li><li> Coloque la aguja de inyección a las 3 horas, asegúrese de que no hay células madre embrionarias en la punta de la aguja, y aplicar piezo-el pulso hasta que la aguja penetra a través de la zona pelúcida y la trophectoderm en el blastocele. </li><li> Lanzar una células madre embrionarias pocos (5-15 células), de modo que las células madre embrionarias se adhieren a la ICM. Continúe hasta que todos los blastocistos del grupo han sido inyectados con células madre embrionarias. </li><li> Después de un grupo de blastocistos es terminado, lavar dos veces en KSOM-AA y mantenerlos en una caída con KSOM-AA hasta que todos los blastocistos se inyectan. </li></ol> 5. Transferencia de Embriones La transferencia de embriones en mujeres embarazadas pseudo-representa un procedimiento quirúrgico, que debe llevarse a cabo con mucho cuidado y de acuerdo con las directrices del Instituto del investigador. <ol><li> Anestesiar a los ratones hembra receptora, afeitarse el cuadrante inferior derecho, y desinfectar. </li><li> Utilizando unas tijeras abiertas en la piel, y separar el peritoneo de la piel. </li><li> Localizar el ovario a través del peritoneo (punto rojo), y abrir el peritoneo, en las proximidades del ovario. </li><li> Con una pinza, coger con cuidado el oviducto y sacar el útero. </li><li> Recoger a un grupo de alrededor de 10 blastocistos con un capilar conectado a una pipeta de boca. </li><li> Fijar el útero con una pinza, abra un conjunto pequeño en él con una pequeña aguja e insertar el tubo capilar con los blastocistos en el lumen del útero. </li><li> Con cuidado, la liberación de los embriones en el útero, y quitar el capilar. </li><li> Empujar el útero en la cavidad abdominal. </li><li> Localizar los bordes del peritoneo y cerrar con unas cuantas puntadas. </li><li> Cerca de la piel del ratón con algunas grapas. </li><li> Para el dolor postoperatorio, administrar 5 mg por Carprofen mg de peso corporal. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Nuclear de células somáticastransferencia de pre-definidas las células T en B6CF1 fondo. Número absoluto y relativo de los embriones generados a partir de las células CD8 + T y las células madre embrionarias derivadas de blastocistos SCNT. <img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Análisis de flujo de citometría de Representante de los ratones quiméricos inyectados con SCNT células madre embrionarias. Puerta y el número (porcentaje total de células T CD8 +) indica la presencia de determinadas células CD8 + T en ratones quiméricos.

<ol>
	<li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V(D)J+recombination.">V(D)J recombination.</a> Immunol. Rev. 200, 5-5 (2004).</li><li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements.">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).</li><li>Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vigor,+fetal+overgrowth,+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation.">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).</li><li>Kishigami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+improvement+of+mouse+cloning+technique+by+treatment+with+trichostatin+A+after+somatic+nuclear+transfer.">Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).</li><li>Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cloning+with+nucleus+donor+cells+of+different+age+and+type.">Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type.</a> Mol Reprod Dev. 58, 376-376 (2001).</li></ol>

Hemos demostrado aquí que la SCNT puede ser utilizado para generar ratones transnuclear de las células T con especificidad predefinida. Aunque no se muestra aquí, la técnica también podría ser útil para generar ratones transnuclear de las células B, con pre-definidos de especificidad. Una cosa importante a considerar es la cepa y el sexo del ratón, que está infectado o vacunado y se utiliza para aislar células T o B de interés. Dado que las células T y B tienen una muy baja eficiencia de reprogramación en general, se recomienda el uso de híbridos F1 haplotipo deseado. Debido a que la célula donante también determina el sexo, se recomienda el uso de T o células B de ratones machos. Esto significa que sólo los ratones quiméricos hombres que transmiten el TCR o BCR a través de la línea germinal, con ratones machos ser más fácil y más rápido para reproducirse. En conjunto, creemos que a través de la reprogramación epigenética SCNT representa una poderosa herramienta para generar un nuevo tipo de modelos de ratón, que será de gran ventaja para el campo inmunológico.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Red Blood Cell lysis Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R7757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>REF 352340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pregnant Mare Serum (PMS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>367222</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human Chorionic Gonadotropin (HCG)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>230734</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4272</td>
<td>Type IV-S</td>
</tr>
<tr>
<td>KSOM-AA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MR-106-D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HCZB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MR-173-D</td>
<td>Customized medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Ca-free medium for activation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MR-174-D</td>
<td>Customized medium</td>
</tr>
<tr>
<td>SrCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>255521</td>
<td>100mM = 10x</td>
</tr>
<tr>
<td>AlbuMAX I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11020-021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PVP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biotech</td>
<td>102787</td>
<td>Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I</td>
</tr>
<tr>
<td>Cytochalasin B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C6762</td>
<td>500&mu;g/ml = 100x</td>
</tr>
<tr>
<td>Trichostatin A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8552</td>
<td>5mM = 1000x</td>
</tr>
<tr>
<td>Mineral Oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M5310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Holding needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Humagen</td>
<td>MPH-SM-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Injection and transfer needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Humagen</td>
<td>4-15, 7-15, 15-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouth pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Instruments</td>
<td>14088-10</td>
<td>or something similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Instruments</td>
<td>11251-10</td>
<td>or something similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Wound Clip Applicator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>427630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wound Clips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>427630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>K871H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D6429</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30071.03</td>
<td>15%</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-602E</td>
<td>100x</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>101806</td>
<td>200mM = 100x</td>
</tr>
<tr>
<td>Non-essential Aminoacids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11140050</td>
<td>100x</td>
</tr>
<tr>
<td>&beta;-Mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21985-023</td>
<td>5&mu;l in 500ml</td>
</tr>
<tr>
<td>LIF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>ESG1106</td>
<td>1000x</td>
</tr>
<tr>
<td>MEK inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling</td>
<td>9900L</td>
<td>For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50&mu;M)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

transnuclear mice with pre-defined t cell receptor specificities against toxoplasma gondii obtained via scnt

Linfocitos, como las células T, se someten genética V (D) J recombinación, para generar un receptor con una cierta especificidad 1. Ratones transgénicos para reorganizar el antígeno específico de los receptores de células T (TCR) ha sido una herramienta indispensable para estudiar el desarrollo de células T y la función. Sin embargo, los TCR son por lo general aislado de las células T después de la correspondiente a largo plazo la cultura a menudo después de la estimulación repetida de antígenos, que inevitablemente selecciona las células T con alta afinidad. Integración al azar del genoma de la TCR α-β y de la cadena y la expresión de la no endógena promotores pueden dar lugar a variaciones en el nivel de expresión y la cinética. Reprogramación epigenética mediante transferencia nuclear de células somáticas es una herramienta para generar células madre embrionarias y los ratones de cualquier célula de interés. En consecuencia, cuando SCNT se aplica a las células T de especificidad conocida, estos recursos genéticos V (D) J reordenamientos se transfieren a las células madre embrionarias-SCNT (CES) y los ratones derivadas de ellos, mientras que las marcas epigenéticas se restablecen. Hemos demostrado que las células T con pre-definido las especificidades contra Toxoplasma gondii se puede utilizar para generar modelos de ratones que expresan el TCR específicos de sus loci endógena, sin modificación genética introducida experimentalmente. La relativa facilidad y rapidez con que estos modelos transnuclear se puede obtener una promesa para la construcción de modelos de otras enfermedades.

Watch this Scientific Journal Video about Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT at JoVE.com

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Estamos aquí demostrar que la reprogramación epigenética mediante transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) puede ser utilizado como una herramienta para generar modelos de ratones con la pre-definido de receptores de células T (TCR) especificidades. Estos ratones transnuclear expresar la correspondiente TCR de su locus endógeno bajo el control del promotor endógeno.

Los ratones con Transnuclear predefinidos Especificidades receptor de células T contra la Toxoplasma gondii Obtenidos a través de la SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

transnuclear-mice-with-pre-defined-t-cell-receptor-specificities

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

14.0K vistas.  Whitehead Institute for Biomedical Research. Estamos aquí demostrar que la reprogramación epigenética mediante transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) puede ser utilizado como una herramienta para generar modelos de ratones con la pre-definido de receptores de células T (TCR) especificidades. Estos ratones transnuclear expresar la correspondiente TCR de su locus endógeno bajo el control del promotor endógeno.

Video: Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

Obtener altamente purificada Toxoplasma gondii Los ooquistes por un gradiente de cloruro de cesio discontinua

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Investigación

Inmunología e Infección

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Quiste Toxoplasma gondii Muro de Formación en Activado médula ósea procedentes de los macrófagos y Condiciones bradizoíto

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Una pantalla genética para aislar Toxoplasma gondii Célula huésped-mutantes Egress

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

La manipulación genética en<em&gt; Δku80</em&gt; Las cepas de Análisis Genómico Funcional de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Adelante Genética pantallas usando macrófagos identificar<em&gt; Toxoplasma gondii</empara la resistencia a IFN-γ por células dependiente&gt; Genes Importante Inmunidad Autónoma

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Retroviral transducción de células progenitoras de médula ósea para generar las células T del receptor Retrogenic ratones

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Desarrollo de derivados de células madre Las células T reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

Identificación de mediadores del Receptor de células T de señalización a través de la proyección de las bibliotecas del inhibidor químico

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational methods, such as next generation sequencing (NGS), yield enormous sets of data on the antibody repertoire at the sequence level, functional data is required to identify which sequences are relevant for a particular antigen or set of antigens. Here, we describe a method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from a human blood donor. This method utilizes an initial enrichment of mature B cells and requires a combination of phenotypic cell markers and fluorescently-labeled protein to isolate IgG memory B cells via flow cytometry. The heavy and light chain variable regions are then cloned and re-screened. Although limited to the memory B cell compartment, this method takes advantage of flow cytometry to interrogate millions of B cells and returns paired heavy and light chain sequences from a single cell in a format ready for expression and confirmation of specificity. Antibodies recovered with this method can be considered for therapeutic potential, but can also link specificity and function with bioinformatic approaches to assess the B cell repertoire within individuals.

The BSelex method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from human peripheral blood mononuclear cells combines flow cytometry with single cell PCR and cloning.

Método de cribado de una sola célula para la selección y recuperación de anticuerpos con especificidades deseadas de poblaciones de células B de memoria humana enriquecidas

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...

Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of liver cancer. This is a major concern, especially in developing countries. Failure of the immune system to mount an effective response against HBV leads to chronic infection. Although HBV vaccine is present and novel antiviral medicines are being created, eradication of virus-reservoir cells remains a major health topic. Described here is a method for the generation of viral antigen (Ag) -specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) (i.e., iPSC-CTLs), which have the ability to suppress HBV replication. HBV replication is efficiently induced in mice through hydrodynamic injection of an HBV expression plasmid, pAAV/HBV1.2, into the liver. Then, HBV surface Ag-specific mouse iPSC-CTLs are adoptively transferred, which greatly suppresses HBV replication in the liver and blood as well as prevents HBV surface Ag expression in hepatocytes. This method demonstrates HBV replication in mice after hydrodynamic injection and that stem cell-derived viral Ag-specific CTLs can suppress HBV replication. This protocol provides a useful method for HBV immunotherapy.

Presented here is a protocol for the effective suppression of hepatitis B virus (HBV) replication in mice by utilizing adoptive cell transfer (ACT) of stem cell-derived viral antigen (Ag)-specific T lymphocytes. This procedure may be adapted for potential ACT-based immunotherapy of HBV infection.

Linfocitos T virales derivados de células madre suprimen la replicación del VHB en ratones

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of ...