Damos las gracias a todo el laboratorio Koshy útil para los debates. Damos las gracias a Patty Jansma y la Universidad de Arizona Departamento de Neurociencia de consejos y ayuda con las imágenes. También agradecemos el laboratorio Porreca para el uso de su Vibratome. Esta investigación fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH NS065116, AAK).

NOTA: Los ratones fueron criados y mantenidos en un ambiente controlado de temperatura y humedad con 12 hr invertido ciclos de luz / oscuridad con alimento y agua ad libitum en la Universidad de Arizona. Los experimentos se llevaron a cabo bajo las directrices y aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Arizona. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Los ratones Cre-reportero están en un C57BL / 6 de fondo 11 y están disponibles comercialmente. 1. Ratón Infección NOTA: El método de infección de ratón con Toxoplasma gondii se describe a continuación ha sido utilizado en los estudios previamente publicados 10 - 12. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Cultivar las cepas de Toxoplasma en fibroblastos de prepucio humano (HFFS) cultivadas en alta glucosa de Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) suplementado con 10% FBS, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml streptomycin, y 2 mM L-glutamina (cDMEM) en un matraz T-25 dentro de una incubadora de CO2 al 5% hasta que los parásitos han formado grandes vacuolas parasitóforas. </li><li> Parásitos de liberación jeringa raspando las células de la parte inferior del matraz y pasar la solución resultante a través de una aguja de calibre 25 conectada a una jeringa de 3 ml 2 veces interior del matraz a continuación, transferir toda la solución a un caso de la jeringa de 5 ml conectada a una aguja de calibre 27 que se ha colocado boca abajo dentro de un tubo cónico de 15 ml. Conecte el émbolo a la jeringa y pasar la solución del parásito en el tubo cónico. </li><li> Centrifugar el tubo durante 10 min a 300 x g. Aspirar el sobrenadante a continuación, resuspender el precipitado en 4-6 grado USP ml estéril 1x tampón fosfato salino (PBS) pH 7,4 (Solución Stock). </li><li> Cargar un hemocitómetro con 10 l de solución madre, esperar 5-10 minutos para que los parásitos se depositan entonces cuentan el número de parásitos en las cuatro esquinas y el centro de la gran plaza central. </li><li> Diluir párrsitios a tamaño del inóculo apropiado de 100K / 200 l 1x PBS luego se inyectan ratones por vía intraperitoneal (ip) con un volumen total de 200 l. NOTA: Para este procedimiento, los ratones fueron inoculados con 100K Tipo III (CEP) 13 taquizoítos en 200 l 1x PBS. Al infectar ratones con otras cepas de Toxoplasma, puede ser necesario ajustar para tener en cuenta el nivel de virulencia concentración de inóculo. </li></ol> 2. Perfusión Cerebral y Cosecha NOTA: Este protocolo se realizó a 21 días después de la infección (dpi), ya que esto representa el punto de tiempo en el que los números máximos de los quistes se encuentran en el cerebro de ratón, pero otros puntos de tiempo puede ser utilizado. Tamaño, el número, la ubicación, y la presencia o ausencia de quistes depende de muchos factores, incluyendo la cepa de ratón, parásito cepa de tipo, así como el tamaño del inóculo 7,14 - 17. Los investigadores deberán determinar individualmente el inóculo adecuado para el ratón y Toxoplascepa ma él / ella utiliza. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Configuración de todas las herramientas de cosecha quirúrgicos (Figura 1). </li><li> Para cada ratón, preparar y mantener en hielo: jeringa de 20 ml lleno con 0,9% de cloruro de sodio (NaCl) + 10 U / ml de heparina en 1x grado USP estéril PBS (heparina / solución salina); 20 ml jeringa llena con 4% de paraformaldehído (PFA); Vial de centelleo con 15 ml de PFA al 4%. Para múltiples ratones, preparar un vaso lleno de toda la cantidad de cada solución necesaria para todos los ratones luego elaborar una jeringa fresca llena de solución para cada perfusión. </li><li> Anestesiar al ratón ip con 200 l / 25 g de peso corporal de ketamina cóctel / xilazina (24 mg / ml y 4,8 mg / ml, respectivamente) en el día de su interés. Monitorear el ratón para el nivel de anestesia comprobando reflejo pizca dedo del pie. Continúe con el protocolo sólo una vez que el ratón no muestra respuesta a una pizca dedo del pie firme. NOTA: Otros métodos de anestesia se puede utilizar siempre y cuando se alcanza el nivel apropiado de anestesia antesde proceder con el protocolo. </li><li> Coloque el ratón en la posición supina sobre la plataforma de espuma cubierto. Pin las cuatro extremidades a cabo en los pies y luego rociar el pecho y el abdomen con un 70% de etanol (EtOH) (Figura 2). La adición de varias toallas de papel estéril bajo el ratón puede ser utilizado para ayudar a absorber el desbordamiento de los fluidos de perfusión. </li><li> Levante la piel justo debajo del esternón con pinzas a continuación, utilizar tijeras para hacer una incisión. Tire de la piel para exponer el pecho (Figura 2B). </li><li> Levante xifoides proceso y hacer una incisión abdominal justo debajo del diafragma, exponiendo el hígado que se disección roma de distancia desde el diafragma. Hacer dos incisiones, una a la izquierda y de la derecha a través del diafragma y la parte inferior de las costillas. Extender las incisiones izquierda y derecha aproximadamente 1 / 2-2 / 3 manera encima de la caja torácica, que se refleja a continuación, volver a abrir la cavidad torácica (Figura 2C). NOTA: Tenga cuidado de no cortar cualquier órgano o los vasos sanguíneos principales dusonar este procedimiento ya que al hacerlo se comprometer la calidad de la perfusión. </li><li> Perfundir transcardially con 10-20 ml de heparina / solución salina seguido de 10-20 ml 4% PFA. NOTA: Si la perfusión se realiza correctamente, el hígado cambia de rojo a bronceado (Figura 2D). Si no se hace correctamente, los vasos sanguíneos serán visibles (Figura 2E). </li><li> Ponga el ratón sobre su abdomen, pies re-pin luego rociar la cabeza y el cuello con EtOH al 70%. Levantar la piel de la base del cuello y hacer una incisión. Quite la piel para exponer el cráneo (Figura 2F). Decapitar a la cabeza al nivel de los hombros. Retire el cráneo, retire con cuidado el cerebro, y colocarlo en un vial de centelleo lleno de PFA al 4% (Figura 2G-H). NOTA: Si bien perfundido, aparecerá blanca sin vasos sanguíneos visibles (Figura 2I) del cerebro. Si el cerebro no está bien perfundido, los vasos sanguíneos serán visibles (Figura 2J). </li><li> Coloque el scintillación vial con el cerebro en el 4% PFA a 4 ° C durante la noche, cubierto de la luz. Enjuague el cerebro en USP no de grado 1 × PBS y traslado a un nuevo vial de centelleo lleno de frío 1x PBS. Guarde el cerebro en 1x PBS a 4 ° C, protegido de la luz. NOTA: claro éxito y la imagen se ha logrado con secciones almacenados en 1x PBS hasta por un mes, pero lo mejor es la sección es el cerebro en pocos días como el almacenamiento prolongado en PBS invertirá la fijación PFA y podría conducir a menos de imágenes óptimas . Autofluorescencia y el aumento de la falta de definición se han observado en algunas secciones fotografiados después de un almacenamiento en 1X PBS durante un mes o más. </li></ol> 3. Cerebro Seccionado <ol style="margin-left: 40px;"><li> Retire el cerebro desde 1x PBS y colocarlo en una matriz de cerebro (Figura 3) para permitir más precisa e incluso cortes a través del cerebro. Se quita los bulbos olfatorios cerebelo y, si está presente, y luego se corta el cerebro coronal en 2 o 3 secciones. <br /&gt; NOTA: El recorte y corte del cerebro puede hacerse sin la ayuda de una matriz de cerebro. Número de secciones cortadas coronal dependerá de la distancia de corte de la Vibratome siendo utilizado. El cerebro puede ser seccionado en cualquier orientación, aunque secciones sagitales y coronales son los más utilizados para la identificación neuroanatómica. </li><li> Pegue cada sección del cerebro en un bloque de montaje espécimen con cianoacrilato. Colocar un pequeño bloque de 5% de gel de agarosa detrás de la sección del cerebro de apoyo (Figura 3B). NOTA: Otros mecanismos de apoyo pueden ser utilizados, pero sin el apoyo, la Vibratome pueden hacer presión en el cerebro que causa seccionamiento desigual. </li><li> Cortar tejido en 160 m (distancia de trabajo del objetivo utilizado para formación de imágenes) secciones gruesas con el Vibratome ajusta a una velocidad de 4 y la amplitud de 9. NOTA: Los ajustes para la velocidad y la amplitud pueden ajustarse dependiendo de la máquina particular que se usa con el fin de obtener incluso, las secciones lisas. Si los valores sonno es correcto, el resultado puede ser secciones desiguales, desgarro de marcas de tejidos o charla. </li><li> Recoger las secciones de tejido en un vial de centelleo lleno de frescos, refrigerados 1x PBS si van a ser limpiado en una semana. Si las secciones no van a ser limpiado en una semana, lugar secciones en 1,5 ml tubos de microcentrífuga llenas de solución crioconservante y almacenar a -20 ° C. </li></ol> 4. Compensación óptica de secciones de tejido cerebral NOTA: Este protocolo ha sido modificado a partir de un método publicado previamente 8. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Preparar 25%, 50%, 75% y 90% de glicerol vol / vol en 1X PBS + 2% de Tween-20 (Gl / PBST). </li><li> Retire secciones de 1x PBS o, si en crioconservante, enjuague en PBS 1x y transferir a un vial de centelleo que contiene 10 ml de 25% Gl / PBST. Colocar el vial en un agitador a 4 ° C, cubierta de la exposición a la luz, durante 12 h. </li><li> Confirme que todas las secciones se han hundido a la bottom del vial. Aspirar el 25% Gl / PBST, dejando sólo lo suficiente para cubrir las secciones a continuación, llenar el frasco con 10 ml de 50% Gl / PBST y se deposita en un agitador a 4 ° C, cubierto por la exposición a la luz, durante 12 horas. Repita este proceso para el 75% Gl / PBST entonces el 90% Gl / PBST. Deja secciones en el 90% Gl / PBST durante 24 horas para llegar a la compensación máxima. En el transcurso del proceso de compensación, observar compensación óptica gradual (Figura 4). NOTA: Este proceso puede acelerarse si las soluciones se cambian inmediatamente después de las secciones han hundido en el fondo del vial. En el 75% y 90% de soluciones, las secciones no se hundirán todo el camino hasta la parte inferior del vial, pero flotan en el medio. </li></ol> 5. Montaje de secciones de tejido cerebral <ol style="margin-left: 40px;"><li> Corte un No. 1.5 cubreobjetos en 5 piezas para crear un espaciador. Use un lápiz regla y con punta de diamante para anotar y romper el cubreobjetos lo largo de las líneas de trazo discontinuo en la figura 5A. Descartar tque centrar pieza, organizar las 4 piezas exteriores en un portaobjetos de vidrio claro para crear una ventana, y luego cepille esmalte transparente en las costuras para adherir las piezas del separador a la diapositiva en la configuración correcta (Figura 5B). NOTA: El separador se utiliza para crear el espacio necesario entre la corredera y el cubreobjetos para el montaje de las secciones despejadas. El cubreobjetos se puede cortar en diferentes formas de crear cualquier tamaño de ventana necesario. Espaciadores de espuma precortadas también están disponibles comercialmente. Para permitir que el esmalte de uñas se seque por completo, lo mejor es hacer diapositivas con espaciadores al menos un día antes de las secciones de montaje. </li><li> Secciones de traslado a una diapositiva utilizando una pipeta de plástico con la punta cortada. Asegúrese de llenar en los alrededores con un 90% Gl / PBST. Baje cuidadosamente un cubreobjetos sobre las secciones, asegurándose de no introducir burbujas. El exceso de Gl / PBST puede ser malo lejos con un sin pelusas limpie. </li><li> GFP Imagen + neuronas que contienen RFP + <em&gt; Quistes de Toxoplasma gondii con un microscopio confocal de inmediato (Figura 7A-B) y luego almacenar diapositivas plana y protegido de la luz a 4 ° C. NOTA: Como alternativa, el sello se desliza completamente alrededor de todos los bordes para almacenar y fotografiados en un momento posterior. El uso de esmalte de uñas transparente para sellar diapositiva es opcional y es posible que sea más difícil de quitar cubreobjetos si uno fuera a eliminar secciones de la diapositiva en una fecha posterior para su posterior procesamiento. </li></ol> 6. Imaging NOTA: Cualquier microscopio puede ser usado que tiene la capacidad de obtener de alta resolución z-pilas. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Después de encontrar inicialmente el plano focal en 10 veces, cambiar a un objetivo de 20X y escanear a través de la sección para identificar un quiste localizado en el interior de un GFP + células. Centre la región de interés (ROI) en el campo de visión. </li><li> Cambie a un objetivo de 40X. Enfoque arriba y hacia abajo a través de toda la ROI para asegurarse de que toda la célula y Cyst son visibles. NOTA: Las imágenes se obtuvieron usando un microscopio confocal con un objetivo de 40X / 1.30 Petróleo DIC M27. </li><li> Utilizando el software de imágenes instalado, obtener una pila z que incluye toda la celda con un quiste. Promedio de ajustes utilizados para obtener las imágenes se muestran en la Figura 6. NOTA: Los ajustes pueden necesitar ser ajustado en función de cada una las secciones de tejido investigadores y capacidades de microscopio. </li><li> Obtener una imagen de máxima proyección de la z-stack estableciendo el número de proyecciones a 1. Obtenga una vista rotación completa estableciendo el número de proyecciones a 64. NOTA: Otros paquetes de software están disponibles y pueden ser usados ​​para obtener la máxima proyección, de rotación, así como otros puntos de vista de imágenes z-pila. </li><li> Analizar imagen con el software de análisis de imágenes. </li></ol>

<ol>
	<li>Luft, B., Remington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasmic+encephalitis+in+AIDS.">Toxoplasmic encephalitis in AIDS.</a> Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).</li><li>Hill, D., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+transmission,+diagnosis+and+prevention.">Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention.</a> Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).</li><li>Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+infected+with+low-virulence+strains+of+Toxoplasma+gondii+lose+their+innate+aversion+to+cat+urine,+even+after+extensive+parasite+clearance.">Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance.</a> PloS one. 8 (9), 75246 (2013).</li><li>Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -. P., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+Toxoplasma+gondii+cyst+distribution+in+the+forebrain+associate+with+individual+variation+in+predator+odor+avoidance+and+anxiety-related+behavior+in+male+Long-Evans+rats.">Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats.</a> Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).</li><li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-parasite+relationship+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+chronically+infected+mice.">The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice.</a> Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411 (1), 39-43 (1987).</li><li>Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+changes+in+the+brains+of+mice+infected+with+Toxoplasma+gondii:+a+histological,+immunocytochemical+and+ultrastructural+study.">Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study.</a> Int J Exp Pathol. 72 (4), 463-474 (1991).</li><li>Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Preference+of+Toxoplasma+gondii+Cysts+in+Murine+Brain:+A+Confocal+Study.">Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study.</a> J Neuroparasitology. , (2010).</li><li>Selever, J., Kong, J. -. Q., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+approach+to+high-resolution+fluorescence+imaging+in+semi-thick+brain+slices.">A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li><li>Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+secreting+Cre+recombinase+for+analysis+of+host-parasite+interactions.">Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions.</a> Nat Methods. 7 (4), 307-309 (2010).</li><li>Koshy, A. a., Dietrich, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+co-opts+host+cells+it+does+not+invade.">Toxoplasma co-opts host cells it does not invade.</a> PLoS pathog. 8 (7), (2012).</li><li>Madisen, L., Zwingman, T. a., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Caffaro, C. E., Koshy, A. s., Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nucleotide+sugar+transporter+involved+in+glycosylation+of+the+Toxoplasma+tissue+cyst+wall+is+required+for+efficient+persistence+of+bradyzoites.">A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites.</a> PLoS pathog. 9 (5), (2013).</li><li>Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+among+the+three+major+strains+of+Toxoplasma+gondii+and+their+specific+interactions+with+the+infected+host.">Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host.</a> Trends in parasitology. 21 (10), 476-481 (2005).</li><li>Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Structures+of+Toxoplasma+gondii+tachyzoites,+bradyzoites,+and+sporozoites+and+biology+and+development+of+tissue+cysts.">a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts.</a> Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 .</li><li>Prandota, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Link+Between+Toxoplasma+Gondii+and+the+Anosmia+Associated+With+Neurodegenerative+Diseases.">Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases.</a> Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).</li><li>Berenreiterov&#225;, M., Flegr, J., Kub&#283;na, A., N&#283;mec, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+Toxoplasma+gondii+cysts+in+the+brain+of+a+mouse+with+latent+toxoplasmosis:+implications+for+the+behavioral+manipulation+hypothesis.">The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis.</a> PloS one. 6 (12), 28925 (2011).</li><li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrastructural+study+of+the+early+development+and+tissue+cyst+formation+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+mice.">An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice.</a> Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).</li><li>De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+agents+and+neurodegeneration.">Infectious agents and neurodegeneration.</a> Mol Neurobiol. 46 (3), 614-638 (2012).</li><li>Scott, C. a., Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+abnormalities+in+neurons+are+sufficient+to+explain+the+clinical+disease+and+fatal+outcome+of+experimental+rabies+in+yellow+fluorescent+protein-expressing+transgenic+mice.">Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice.</a> J Virol. 82 (1), 513-521 (2008).</li><li>Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Dado que los cambios celulares en las células huésped infectadas han sido vinculados a resultados de la enfermedad en infecciones con otros organismos intracelulares tales como el VIH, la rabia, y Chlamydia 18,19, hemos desarrollado una técnica que nos permitirá estudiar las interacciones íntimas que se producen entre el SNC sede de célula y Toxoplasma. El método aquí descrito logra este objetivo al permitir imágenes eficiente de las neuronas infectadas crónicamente. Antes del desarrollo de...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>. The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:
 Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>.

Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

El objetivo general de este método es la obtención de alta resolución, las imágenes tridimensionales de las neuronas individuales que están infectadas por el parásito intracelular obligado Toxoplasma gondii. Toxoplasma se considera a menudo uno de los parásitos más exitosos debido a su gran rango de huésped intermediario, que incluye seres humanos y roedores. En los seres humanos y roedores, después de la infección aguda por ingestión de alimentos o agua contaminados, Toxoplasma es capaz de provocar una infección persistente del SNC mediante la conversión de su forma de replicación rápida (taquizoíto) a su lenta replicante y encysting forma (la bradyzoite ). En individuos inmunocompetentes, se cree que esta infección latente CNS a ser relativamente asintomática, pero en individuos inmunocomprometidos, como los pacientes con SIDA o receptores de trasplantes, el recrudecimiento del parásito puede provocar encefalitis por toxoplasma 1,2 fatal. Además, estudios recientes hahan demostrado que la infección latente por Toxoplasma puede conducir a cambios de comportamiento en roedores 3,4, aunque el mecanismo sigue siendo desconocido. Sorprendentemente, a pesar de estos datos destacan la importancia de la interacción CNS Toxoplasma, se sabe relativamente poco acerca de esta relación, sobre todo a nivel celular y molecular. La capacidad para estudiar los aspectos más simples de la interacción parásito-cerebro se ha visto obstaculizada en parte por las limitaciones tecnológicas. Por ejemplo, la mayoría del trabajo que demuestra que las neuronas son las células en las que los quistes persisten se ha hecho con la microscopía electrónica (EM) 5,6. Aunque EM da alta resolución, es mucho tiempo, mano de obra intensiva, y caro. Ensayos de inmunofluorescencia (IF) han sido recientemente utilizado en conjunción con la microscopía confocal para confirmar el trabajo realizado por EM 7. Si los análisis son técnicamente fácil de realizar y relativamente barato, pero el uso de estas técnicas para understand la relación espacial entre el quiste y la neurona infectado requiere la reconstrucción de serie, que es mucho tiempo, técnicamente difícil, y puede conducir a la pérdida de información valiosa. Por lo tanto, hemos desarrollado un método que se puede utilizar con el modelo de ratón de la toxoplasmosis CNS y nos permite la imagen de la totalidad de las neuronas infectadas sin EM o inmunohistoquímica (IHC). Mediante el desarrollo de esta técnica, podemos empezar a explorar la relación entre el celular de la célula infectada y el quiste de una manera relativamente rápida y económica. El método que hemos desarrollado combina nuevas técnicas para la compensación óptica y de imagen secciones de cerebro de espesor por microscopía confocal 8 con un sistema que marca en las células in vivo que han sido inyectados con proteínas del parásito 9,10. En este sistema, se infectan ratones Cre-reportero que expresan una proteína fluorescente verde (GFP) sólo después de la recombinación Cre-11 mediada con Toxoplasma </em&gt; Cepas que expresan una proteína fluorescente roja (RFP) y se inyectan la recombinasa Cre en las células huésped 9. Esta combinación nos permite cosechar el cerebro de ratón infectado después de establecida la infección del SNC, cortar secciones de cerebro de espesor, y rápidamente identificar las áreas pertinentes a la imagen mediante la búsqueda de la RFP + quistes. Es importante tener en cuenta que a medida que la expresión célula hospedadora de la GFP depende únicamente de la inyección de Cre por parásitos, y no en la infección, un número de las células GFP + no contienen parásitos 10. Como el objetivo de este protocolo es capaz de neuronas infectadas imagen enteros, la atención se centra sólo en las buenas prácticas agrarias + neuronas que contienen también un RFP + quiste, pero el protocolo también se puede usar para la imagen de la GFP + / RFP - neuronas. Una vez que el cerebro infectado se cosecha y se seccionó, las secciones se convierten transparente por compensación de glicerol. Regiones apropiadas de secciones se avistaron con microscopía confocal, almugido visualización sin precedentes de las células huésped infectadas y los parásitos enquistados en su totalidad. Aquí le ofrecemos un completo protocolo para la identificación, la compensación óptica y, a las neuronas de imágenes infectado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1877">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:265px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:1008px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome Series 1000 Sectioning System</td>
			<td>Technical Products International, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Other vibratomes are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#1.5 Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond Scriber</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52865-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketaject&#174; Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml</td>
			<td>Western Medical Supply, Inc.</td>
			<td>4165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnaSed&#174; Injection Xylazine 20mg/ml</td>
			<td>Lloyd Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZsGreen Mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>7906</td>
			<td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>These are primary cells from human foreskins.&#160; We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Penicillin Streptomycin Solution, 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">200mM L-alanyl-L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:469px;">25cm2 Canted neck flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1012639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade</td>
			<td>amresco</td>
			<td>K813-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:265px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Bright-Line Hemocytometer</td>
			<td style="width:265px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Brain Slicer Matrix</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>BSMAS005-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:265px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:135px;">H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:265px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">20ml Disposable Scintillation Vials</td>
			<td style="width:265px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">FS74500-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof</td>
			<td style="width:265px;">In-house</td>
			<td>17212945</td>
			<td>This product is purchased from an in-house stockroom.&#160; Other companies are compatible.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Imaris Software</td>
			<td style="width:265px;">Bitplane</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Clear nail polish</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Other brands are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">10ml Syringe with Luer-Lok</td>
			<td style="width:265px;">VWR</td>
			<td>BD309604</td>
			<td>Other syringes are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Three-way Stopcock</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Hypodermic needle</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible - used to pin down mouse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25G x 12&#34; Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter</td>
			<td style="width:265px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:135px;">450099</td>
			<td>Other brands are compatible</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3-d imaging and analysis of neurons infected in vivo with toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado con una amplia gama de huéspedes, incluidos los seres humanos y roedores. En los seres humanos y roedores, Toxoplasma establece una infección persistente de por vida en el cerebro. Mientras que esta infección cerebral es asintomática en la mayoría de las personas inmunocompetentes, en el desarrollo del feto o personas inmunodeprimidas, como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) pacientes, esta predilección por y persistencia en el cerebro puede conducir a la enfermedad neurológica devastadora. Por lo tanto, es evidente que la interacción de cerebros Toxoplasma es crítico para la enfermedad sintomática producida por Toxoplasma, sin embargo, tienen poco entendimiento de la interacción celular o molecular entre células del sistema nervioso central (CNS) y el parásito. En el modelo de ratón de la toxoplasmosis del SNC se ha conocido por más de 30 años que las neuronas son las células en las que el parásito persiste, pero hay poca información disponible sobre la queparte de la neurona es generalmente infecta (soma, dendritas, axón) y si esta relación celular cambia entre cepas. En parte, esta falta es secundaria a la dificultad de formación de imágenes y la visualización de las neuronas infectadas enteras de un animal. Estas imágenes se suelen requerir seccionamiento en serie y costuras de tejido fotografiado por microscopía electrónica o microscopía confocal después de inmunotinción. Mediante la combinación de varias técnicas, el método descrito aquí permite el uso de secciones gruesas (160 micras) para identificar y células de imagen completa que contienen quistes, lo que permite la visualización y el análisis de las neuronas individuales, crónicamente infectadas en tres dimensiones sin la necesidad de inmunotinción, microscopía electrónica o seccionamiento y la costura serie. Usando esta técnica, podemos comenzar a entender la relación celular entre el parásito y la neurona infectada.

La Figura 7 incluye imágenes representativas de dos GFP + neuronas a partir de dos secciones diferentes 160 m de espesor, así como una medición representativa de la distancia desde quiste a célula-cuerpo para la Figura 7B. Cifras que contiene quiste-7 A y B ilustran que este nuevo protocolo permite la visualización de la neurona infectada en su totalidad. La Figura 7C muestra que con esta técnica de imagen, ahora es pos...

Watch this Scientific Journal Video about 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii at JoVE.com

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

El uso de este protocolo, hemos sido capaces de imagen de 160 micras de espesor secciones de cerebro de ratones infectados con el parásito Toxoplasma gondii, que permite la visualización y el análisis de la relación espacial entre el parásito enquistamiento y la neurona infectada.

Imaging 3-D y Análisis de neuronas infectadas<em&gt; En Vivo</em&gt; Con<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

3-d-imaging-analysis-neurons-infected-vivo-with-toxoplasma

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

11.4K vistas.  University of Arizona.  El uso de este protocolo, hemos sido capaces de imagen de 160 micras de espesor secciones de cerebro de ratones infectados con el parásito Toxoplasma gondii, que permite la visualización y el análisis de la relación espacial entre el parásito enquistamiento y la neurona infectada. 

Video: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

Escalable neumático matrices inyector para Viral focalización de los circuitos cerebrales intactas en 3-D

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Investigación

Neurociencias

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

Imagen óptica de neuronas en el ganglio Cangrejo Stomatogastric con tintes sensibles al voltaje

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Marcaje fluorescente retrógrada Permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas<em&gt; En vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Modificación de un Colliculo-tálamo-cortical del ratón Cerebro Loncha, incorporación de la impresión 3-D de la Cámara Componentes e Imagen óptica multi-escala

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

En Vivo La proyección de imagen multimodal y análisis del modelo de neovascularización coroidea inducida por láser Mouse

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

En Vivo Proyección de imagen de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

Generación de hidrogeles a base de colágeno 3D para analizar el crecimiento y el comportamiento axonal durante el desarrollo del sistema nervioso

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.