Os autores são gratos a H. Eisen, Gubbels M., K. van Grinsven, Guillen E., A. Drake, Mahajan V., Gao P. e G. Yap para discussões frutíferas e reagentes. Somos gratos a J. Dausman, Flannery R. e J. Jackson para a assistência com a gestão da colônia mouse. Somos gratos a P. Wisniewski para FACSorting. EMF foi apoiado pelo Programa Human Frontiers Science. RJ foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde concede RO1-HD045022 e R37-CA084198. HLP foi suportado por concessões do National Institute of Health.

Este método foi utilizado na pesquisa, publicada na <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/328/5975/243">Kirak et al. Ciência 328 (5975), 243-248 (2010)</a> . 1. Isolamento de células do doador Antes T específicos ou células B podem ser usados ​​como células do doador para gerar modelos de ratos transnuclear, ratos precisam ser infectado por um patógeno de interesse ou imunizados com um antígeno de interesse. Uma vez que temos utilizado células CD8 + específicas para Toxoplasma gondii, o protocolo a seguir irá descrever a geração eo isolamento dessas células e precisa ser adaptado de acordo com interesses pessoais. <ol><li> Cistos são derivados de um homogenato de cérebro de rato (cerca de 40) são injetados intra-peritoneally em BL / 6 x Balb / c F1 (B6CF1) camundongos, que permite o isolamento de ambos H-2 b e H-2 d restrito células T CD8 +. </li><li> No pico da resposta imune, o rato infectado é sacrificados, o baço isolados e colocados em um prato contendo 6 mL de glóbulos vermelhos (RBC) tampão de lise. </li><li> Usando os lados fosco de duas lâminas de cobertura, o baço é cuidadosamente chão e incubadas no tampão de lise RBC por 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 14 mL PBS, filtrar a suspensão de células através de um filtro de células (40 ou 70 mm) em um tubo de 50 mL falcon e centrifugar por 5 min a 300g. </li><li> Remover o sobrenadante, ressuspender o pellet celular em 1 mL de PBS e transferir para um tubo Eppendorf 1,5 mL. Centrifugar por 5 min em 300g e remover o sobrenadante depois. </li><li> Ressuspender o pellet celular em 50 mL PBS, adicione anticorpos fluorescente etiquetado para identificar o tipo de células de interesse (por exemplo, CD3, B220, CD8 e CD4), e fluorescente etiquetado MHC-I tetrâmero (MHC-II tetrâmero de células CD4 T) carregados com o peptídeo de interesse para a suspensão de células e incubar por 30 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar 1 mL de PBS, centrifugue por 5 min a 300 g, ressuspender sedimento em 3 ml de PBS, e filtrar a suspensão de células através de um filtro de células (40 ou 70 mm) em um tubo. </li><li> Executar FACSorting definindo as portas rigorosamente (Figura 1B). </li></ol> 2. Transferência nuclear de células somáticas Existem alguns protocolos para somáticas. O aqui descrito faz uso de ovócitos preso em Metáfase II e da inibição da segunda divisão meiótica utilizando citocalasina B. Portanto células do doador são necessários que estão em fase G0/G1. <ol><li> Preparação de oócitos <ol><li> Camundongos fêmeas da BDF1 fundo são injetados intra-peritoneally com 5IU PMS rato por cinco horas - sete horas. </li><li> Cerca de 47 horas depois, cada rato é injetado intra-peritoneally com HCG 5IU. </li><li> Prepare um prato de cultura (KSOM-AA cai sob óleo) para os ovócitos no mesmo dia como a injeção de HCG e colocá-los em uma incubadora a 37 ° C, 5% CO 2. Além disso, preparar as agulhas necessárias para SCNT (7μm para enucleação e 4 ou 5m de transferência nuclear de núcleos de linfócitos) por carregá-los com mercúrio. </li><li> Euthanize ratos e isolar ovidutos sobre 13h após HCG (aproximadamente 8:00). Recolher os ovidutos em 1-2 gotas de HCZB. </li><li> Um por um movimento do oviduto em uma queda contendo M2 w / Hialuronidase. Nick oviduto a cuidadosamente com uma pinça e passar o oócito-cumulus complexo para a queda. Afinal oócito-cumulus complexos foram isolados, o prato é incubada a 37 ° C. </li><li> Depois de 2-5 min (o tempo exato depende do lote de Hialuronidase) recolher os ovócitos, lave em HCZB e placa-los em KSOM-AA gotas. </li></ol></li><li> Enucleação de ovócitos <ol><li> Use a tampa de uma placa de Petri para preparar o prato TNCS. Configure o microscópio, e os micromanipulador. </li><li> Lavar a agulha enucleação (7 mm) em PVP antes de começar com enucleação. </li><li> Para enucleação, coloque um grupo de ovócitos (10-30) em uma gota de HZCB com citocalasina B (5 mg / mL). Durante a incubação (min. 5 min) line-up os oócitos horizontalmente. </li><li> Tome um ovócito e colocá-lo na frente da agulha segurando. Fixar o óvulo para a agulha segurando pela aplicação de um vácuo. Utilizando a agulha de enucleação, por sua vez o ovócito até o cromossomo eixo complexas (CSC, muitas vezes chamado de &quot;núcleo&quot;) está na posição de 3 horas. </li><li> Usando piezo-pulso penetrar na zona pelúcida cuidadosamente, sem danificar o óvulo. Lugar a abertura da agulha adjacente ao fuso-Metáfase II e aplicar vácuo. O &quot;núcleo&quot; deve mover lentamente para dentro da agulha, ea membrana deve selar-se uma vez que é completamente removido. </li><li> Transferir os oócitos enucleados de volta para as gotas KSOM-AA, e lavá-los várias vezes. E repetir oetapas de nucleação com um novo grupo de oócitos. Continue até que todos os ovos são enucleados ou até cerca de 11:00. </li></ol></li><li> Transferência Nuclear <ol><li> Para a transferência nuclear, troca a agulha enucleação (7 mm) com uma agulha de transferência nuclear (4 ou 5 mm) e lave-o com PVP. </li><li> Coloque as suas células de interesse (por exemplo, células CD8 + T) em uma queda com PVP, misture bem e incubar por um mínimo de 10 min. </li><li> Coloque um grupo de oócitos enucleados (10-30) em uma gota de HCZB com citocalasina B (2,5 mg / mL). Durante a incubação (min. 5 min) line-up oócitos na horizontal, utilizando a agulha de transferência nuclear. </li><li> Pegar uma célula doadora da suspensão de células-PVP e aspire-lo em-e-out até a membrana externa foi quebrada (fragmentos da membrana e citoplasma deve ser visível). Se necessário, um piezo-pulso pode ser aplicada. Uma vez que um núcleo foi isolado, movê-lo um pouco acima na agulha, e continuar a pegar núcleos até que você tenha 10-30. </li><li> Mover-se para a queda contendo os oócitos enucleados alinhados. Fix um ovócito para a agulha segurando pela aplicação de vácuo. Coloque a agulha de transferência nuclear (o núcleo deve ser longe da abertura) adjacente à zona pelúcida e aplicar piezo-pulse até que a agulha atravessou a zona pelúcida. Cuidadosamente mover um núcleo para a ponta da agulha, introduza a agulha do oócito até a ponta da agulha é 2 / 3 dentro. Aplique uma pequena pressão negativa, de modo que um pouco da membrana do oócito está na agulha. </li><li> O próximo passo é muito importante, pois é o único momento em que o óvulo é realmente &quot;aberto&quot;. Aplicar um único pulso de piezo, empurre o núcleo para fora da agulha através da aplicação de pressão positiva, cuidadosamente puxe a agulha para que a ponta é de cerca de 1 / 3 no ovócito, e em seguida, aplicar pressão negativa e continuar a puxar a agulha para selar o ovócito. Repita este passo com cada ovócito. </li><li> Depois de todos os oócitos de um grupo ter recebido um núcleo, que são lavadas e cultivadas em KSOM-AA mídia. Repita este procedimento com todos os ovócitos. </li><li> Após o último grupo foi culturas em KSOM-AA para um mínimo de 30 min, o SCNT-embriões são transferidos para gotas de mídia Ca-livre ativação contendo SrCl2. </li><li> Após 6 horas de ativação, a quantidade de pseudo-pronúcleo (PPN)-positivo SCNT-embriões é determinada. Os embriões são, então, lavadas e cultivadas em KSOM-AA cai para 3,5 dias adicionais até que tenham alcançado o estágio de blastocisto. </li><li> Drogas ou produtos químicos de escolha (como Tricostatina A) podem ser adicionados à ativação e meios de cultura. </li></ol></li></ol> 3.Derivation de células-tronco embrionárias Os blastocistos SCNT pode ser usado tanto para transferi-los para pseudo-grávida do sexo feminino (também conhecida como clonagem direta ou one-step) ou para derivar células-tronco embrionárias (também conhecida como clonagem indireta ou duas etapas). Uma vez que é muito mais eficiente para gerar células-tronco embrionárias, escolhemos o procedimento em duas etapas. No caso de o cientista está interessado na clonagem direta, a blastocistos podem ser transferidos diretamente para pseudo-grávida fêmeas, conforme descrito na seção 5. Existem muitos protocolos descrevendo a derivação de células-tronco embrionárias. O aqui descrito é uma técnica padrão, que utiliza células alimentadoras e soro fetal bovino. <ol><li> O segundo dia após a transferência nuclear, preparar uma placa de 96-U-bem para a derivação de células ES. </li><li> Adicionar 100 mL de gelatina em cada poço de uma placa de 96-U-bem, incubar por um mínimo de 10 min, e removê-lo depois. </li><li> Descongelar células alimentador e ressuspender em um volume de meio de acordo ESD, por exemplo, células de alimentação equivalente a uma área de 25 cm 2 são ressuspenso em 10 ml de meio de ESD e 200 mL da suspensão de células é adicionado em cada uma das gelatina-bem tratados. </li><li> Coloque a placa em uma incubadora e cultura a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Após 3,5 dias, os embriões devem estar no estágio de blastocisto. </li><li> Prepare um prato estéril bactérias por plaqueamento algumas gotas médias de células ES e thyrode ácido. </li><li> Os blastocistos são primeiro transferidos das gotas KSOM-AA em gotas contendo meio de célula normal ES e lavadas duas vezes. </li><li> Transferir cuidadosamente um grupo de blastocistos (blastocistos 10/05) em uma gota de ácido thyrode e manter lá até que a zona pelúcida se dissolveu. </li><li> Os blastocistos são então transferidos para uma gota com meio ES, lavados duas vezes, e em seguida colocado no alimentador revestido-96-U-bem placa (um blastocisto em um bem). </li><li> Os embriões são então cultivadas por 5-7 dias em uma incubadora a 37 ° CO C, 5% 2 sem perturbá-los. Isto dá ao embrião a um tempottach para a camada de alimentação, e para formar uma conseqüência. </li><li> Prepare placas de 24 poços, por alimentadores de chapeamento em meio ESD em todos os poços, por exemplo, ressuspender o equivalente a 50 alimentador cm 2 em 12 ml de meio de ESD, e adicionar 500 mL da suspensão de células em cada poço. </li><li> Remova cuidadosamente o meio ESD da placa de 96-U-bem com os embriões, lavar cada cavidade duas vezes com 250 mL Hepes (ou PBS), adicionar 50 mL Tripsina e incubar por aproximadamente 5 min a 37 ° C. </li><li> Pipeta cima e para baixo várias vezes, até que caiu distante conseqüência de uma suspensão de uma única célula de transferência em uma placa de 24 poços e incubar a 37 ° CO C, 5% 2., </li><li> Se derivação ESC foi bem-sucedida, colônias ESC deve ser visível após 7-10 dias. </li></ol> Injeção 4.Blastocyst A injeção de blastocistos é uma técnica de rotina para gerar qualquer tipo de modelo de camundongo transgênico. É importante mencionar que a injeção de blastocistos ea sua posterior transferência para pseudo-grávida fêmeas precisa ser cronometrado bem. <ol><li> Primeiro camundongos fêmeas com TPM e HCG como descrito na seção 2.1. Após a injeção de HCG colocar camundongos fêmeas, juntamente com os ratos do sexo masculino (um feminino e um masculino do rato por gaiola). </li><li> No dia seguinte, verifique as fêmeas para plugues. Isso é contado como 0.5dpc (dias pós-coito). </li><li> Embriões fertilizados são então isolados do oviduto conforme descrito na seção 2.1, e cultivadas em KSOM-AA para o adicional de 3 dias. </li><li> Prepare células ES no dia da injeção de blastocisto (3.5dpc). </li><li> Remova o meio de células-tronco embrionárias, lave duas vezes com Hepes (ou PBS), adicione Tripsina e incubar por 5 min a 37 ° C. </li><li> Ressuspender as células tripsinizados com meio ES, placa em um prato, e incubar por 45-60 min a 37 ° C, 5% de CO 2 para reduzir a quantidade de células alimentadoras (feeder células aderem mais rapidamente do que as células ES). </li><li> Transferir a suspensão celular através de um filtro de células (40 ou 70 mm) em um tubo, e centrifugar por 5 min a 1000 rpm. </li><li> Remover o sobrenadante, ressuspender pellet celular em 500 mL de médio ES e armazenar no gelo até ser necessário. </li><li> Prepare a tampa de um prato estéril bacteriana por gotas de revestimento contendo PVP e HCZB. </li><li> Prepare uma agulha M 15, carregando com o mercúrio, colocando-o em posição e lavá-lo com PVP. </li><li> Coloque um grupo de blastocistos (10-30 blastocistos) em uma queda com HCZB, e adicione 50-50 mL suspensão de células ES (depende da concentração) em mais uma gota de HCZB. </li><li> Pick up células ES (5-10 células) com a agulha de injeção. </li><li> Mover-se para a queda com a blastocistos. Alinhar os blastocistos horizontalmente, e fixar uma holding com a agulha através da aplicação de vácuo. </li><li> Utilizando a agulha de injeção de transformar o blastocisto até que a massa celular interna (ICM) está na posição de 9 horas. </li><li> Coloque a agulha de injeção em três horas, certifique-se que não há células-tronco embrionárias na ponta da agulha, e aplicar piezo-pulse até que a agulha de injeção penetra na zona pelúcida e do trofectoderma no blastocoel. </li><li> Liberação de uma células ES poucos (15/05 células), de modo que as células ES ater ao ICM. Continue até que todos os blastocistos de um grupo tenham sido injetados com células-tronco embrionárias. </li><li> Após um grupo de blastocistos terminar, lave-os duas vezes em KSOM-AA e mantê-los em uma gota com KSOM-AA até que todos os blastocistos são injetados. </li></ol> 5. Transferência de Embriões A transferência de embriões em fêmeas grávidas pseudo-representa um procedimento cirúrgico, que precisa ser realizado com muito cuidado e de acordo com as diretrizes do instituto do pesquisador. <ol><li> Anestesiar ratos destinatário do sexo feminino, shave quadrante inferior direito, e desinfectar. </li><li> Tesoura aberta usando a pele, e separar o peritônio da pele. </li><li> Localizar o ovário através do peritônio (mancha vermelha), e abrir o peritônio próximo ao ovário. </li><li> Usando uma pinça, cuidadosamente pegar o oviduto e retirar o útero. </li><li> Pegar um grupo de cerca de 10 blastocistos com um capilar ligado a uma pipeta na boca. </li><li> Fixar o útero com uma pinça, um soco nele toda pequena com uma pequena agulha, e inserir o capilar com o blastocistos para o lúmen do útero. </li><li> Cuidadosamente liberação dos embriões no útero, e remover o seu capilar. </li><li> Empurrar o útero de volta para a cavidade abdominal. </li><li> Localizar as bordas do peritônio e fechá-lo com alguns pontos. </li><li> Feche a pele do rato com alguns grampos. </li><li> Para dor pós-operatória, administrar 5 carprofeno mg por mg de peso corporal. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Nuclear de células somáticastransferência de células pré-definido em T B6CF1 fundo. Números absolutos e relativos de embriões gerados a partir de células CD8 + T e células estaminais embrionárias derivadas de blastocistos TNCS. <img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Análise de fluxo de Representante citometria de camundongos quiméricos injetados com células-tronco embrionárias TNCS. Portão e número (por cento ao total de células CD8 + T) indica a presença de específicos células T CD8 + em camundongos quiméricos.

<ol>
	<li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V(D)J+recombination.">V(D)J recombination.</a> Immunol. Rev. 200, 5-5 (2004).</li><li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements.">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).</li><li>Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vigor,+fetal+overgrowth,+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation.">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).</li><li>Kishigami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+improvement+of+mouse+cloning+technique+by+treatment+with+trichostatin+A+after+somatic+nuclear+transfer.">Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).</li><li>Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cloning+with+nucleus+donor+cells+of+different+age+and+type.">Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type.</a> Mol Reprod Dev. 58, 376-376 (2001).</li></ol>

Nós mostramos aqui que SCNT pode ser usado para gerar ratos a partir de células T transnuclear pré-definidas especificidade. Embora não seja mostrado aqui, a técnica também deve ser usado para gerar ratos a partir de células B transnuclear pré-definidas especificidade. Uma coisa importante a considerar é a tensão e sexo do mouse, que é infectados ou imunizados e usado para isolar T ou células B de interesse. Como as células T e B têm uma eficiência muito baixa reprogramação em geral, recomendamos a utilização de híbridos F1 do haplótipo desejado. Porque a célula doadora também determina o sexo, recomendamos o uso de T ou células B de camundongos machos. Isso significa que apenas homens ratos quiméricos iria transmitir o TCR ou BCR através da linha germinativa, com camundongos machos sendo mais fácil e rápido para se reproduzir. Tomados em conjunto, pensamos que a reprogramação epigenética via SCNT representa uma poderosa ferramenta para gerar um novo tipo de modelos de mouse, que será de grande vantagem para o campo imunológico.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Red Blood Cell lysis Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R7757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>REF 352340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pregnant Mare Serum (PMS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>367222</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human Chorionic Gonadotropin (HCG)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>230734</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4272</td>
<td>Type IV-S</td>
</tr>
<tr>
<td>KSOM-AA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MR-106-D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HCZB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MR-173-D</td>
<td>Customized medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Ca-free medium for activation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MR-174-D</td>
<td>Customized medium</td>
</tr>
<tr>
<td>SrCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>255521</td>
<td>100mM = 10x</td>
</tr>
<tr>
<td>AlbuMAX I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11020-021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PVP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biotech</td>
<td>102787</td>
<td>Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I</td>
</tr>
<tr>
<td>Cytochalasin B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C6762</td>
<td>500&mu;g/ml = 100x</td>
</tr>
<tr>
<td>Trichostatin A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8552</td>
<td>5mM = 1000x</td>
</tr>
<tr>
<td>Mineral Oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M5310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Holding needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Humagen</td>
<td>MPH-SM-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Injection and transfer needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Humagen</td>
<td>4-15, 7-15, 15-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouth pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Instruments</td>
<td>14088-10</td>
<td>or something similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Instruments</td>
<td>11251-10</td>
<td>or something similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Wound Clip Applicator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>427630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wound Clips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>427630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>K871H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D6429</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30071.03</td>
<td>15%</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-602E</td>
<td>100x</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>101806</td>
<td>200mM = 100x</td>
</tr>
<tr>
<td>Non-essential Aminoacids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11140050</td>
<td>100x</td>
</tr>
<tr>
<td>&beta;-Mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21985-023</td>
<td>5&mu;l in 500ml</td>
</tr>
<tr>
<td>LIF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>ESG1106</td>
<td>1000x</td>
</tr>
<tr>
<td>MEK inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling</td>
<td>9900L</td>
<td>For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50&mu;M)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

transnuclear mice with pre-defined t cell receptor specificities against toxoplasma gondii obtained via scnt

Linfócitos, como as células T, são submetidos a genética V (D) recombinação J, para gerar um receptor com uma certa especificidade 1. Camundongos transgênicos para um reorganizados antígeno-específica do receptor de células T (TCR) têm sido uma ferramenta indispensável para estudar o desenvolvimento de células T e função. No entanto, tais TCRs são geralmente isolados a partir de células T relevantes após longo período de cultura, muitas vezes após estimulação antigênica repetida, o que inevitavelmente seleciona para as células T com alta afinidade. Integração genômica aleatória da TCR α e β-corrente e de expressão de não-endógenos promotores podem levar a variações no nível de expressão e cinética. Reprogramação epigenética via transferência nuclear de células somáticas fornece uma ferramenta para gerar células-tronco embrionárias e camundongos a partir de qualquer célula de interesse. Conseqüentemente, quando SCNT é aplicada às células T de especificidade conhecida, estes rearranjos genéticos V (D) J são transferidos para as células-tronco embrionárias SCNT (CES) e os ratos deles derivados, enquanto marcas epigenéticas são repostas. Nós demonstramos que as células T com pré-definidos especificidades contra o Toxoplasma gondii pode ser usado para gerar modelos de ratos que expressam o TCR específicas de seus loci endógena, sem experimentalmente introduziu modificação genética. A relativa facilidade e rapidez com que tais modelos transnuclear pode ser obtido é promissor para a construção de modelos de outras doenças.

Watch this Scientific Journal Video about Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT at JoVE.com

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Demonstramos aqui que a reprogramação epigenética via transferência nuclear de células somáticas (TNCS) pode ser usado como uma ferramenta para gerar modelos de ratos com pré-definidos receptor de células T (TCR) especificidades. Estes ratos transnuclear expressar a TCR correspondente do seu lócus endógeno sob o controle do promotor endógeno.

Ratos Transnuclear com pré-definidos T Especificidades receptor da célula contra a Toxoplasma gondii Obtidos Via TNCS

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

transnuclear-mice-with-pre-defined-t-cell-receptor-specificities

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

14.0K visualizações.  Whitehead Institute for Biomedical Research. Demonstramos aqui que a reprogramação epigenética via transferência nuclear de células somáticas (TNCS) pode ser usado como uma ferramenta para gerar modelos de ratos com pré-definidos receptor de células T (TCR) especificidades. Estes ratos transnuclear expressar a TCR correspondente do seu lócus endógeno sob o controle do promotor endógeno.

Vídeo: Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

Obtenção altamente purificada Toxoplasma gondii Oocistos por um gradiente de cloreto de césio descontínuos

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Imunologia e Infecção

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Toxoplasma gondii Formação parede do cisto no Activated derivadas da medula óssea macrófagos e Condições Bradyzoite

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

A tela de genética para isolar Toxoplasma gondii Host de células mutantes egresso

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Manipulação genética em<em&gt; Δku80</em&gt; Cepas para Análise Genômica Funcional de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Atacante Genetics telas usando macrófagos para Identificar<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; genes importantes celular para Resistance to-IFN-γ Dependente Immunity Autónoma

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Transdução retroviral de Células de Medula Óssea progenitoras para gerar células T Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

Identificação de mediadores do Receptor de células T através da triagem de bibliotecas de inibidor químico de sinalização

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational methods, such as next generation sequencing (NGS), yield enormous sets of data on the antibody repertoire at the sequence level, functional data is required to identify which sequences are relevant for a particular antigen or set of antigens. Here, we describe a method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from a human blood donor. This method utilizes an initial enrichment of mature B cells and requires a combination of phenotypic cell markers and fluorescently-labeled protein to isolate IgG memory B cells via flow cytometry. The heavy and light chain variable regions are then cloned and re-screened. Although limited to the memory B cell compartment, this method takes advantage of flow cytometry to interrogate millions of B cells and returns paired heavy and light chain sequences from a single cell in a format ready for expression and confirmation of specificity. Antibodies recovered with this method can be considered for therapeutic potential, but can also link specificity and function with bioinformatic approaches to assess the B cell repertoire within individuals.

The BSelex method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from human peripheral blood mononuclear cells combines flow cytometry with single cell PCR and cloning.

Método de triagem de célula única para a seleção e recuperação de anticorpos com especificidades desejadas de populações de células B de memória humana enriquecida

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...

Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of liver cancer. This is a major concern, especially in developing countries. Failure of the immune system to mount an effective response against HBV leads to chronic infection. Although HBV vaccine is present and novel antiviral medicines are being created, eradication of virus-reservoir cells remains a major health topic. Described here is a method for the generation of viral antigen (Ag) -specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) (i.e., iPSC-CTLs), which have the ability to suppress HBV replication. HBV replication is efficiently induced in mice through hydrodynamic injection of an HBV expression plasmid, pAAV/HBV1.2, into the liver. Then, HBV surface Ag-specific mouse iPSC-CTLs are adoptively transferred, which greatly suppresses HBV replication in the liver and blood as well as prevents HBV surface Ag expression in hepatocytes. This method demonstrates HBV replication in mice after hydrodynamic injection and that stem cell-derived viral Ag-specific CTLs can suppress HBV replication. This protocol provides a useful method for HBV immunotherapy.

Presented here is a protocol for the effective suppression of hepatitis B virus (HBV) replication in mice by utilizing adoptive cell transfer (ACT) of stem cell-derived viral antigen (Ag)-specific T lymphocytes. This procedure may be adapted for potential ACT-based immunotherapy of HBV infection.

Células-tronco derivadas virais AG-specific T da haste suprimir a replicação de HBV em ratos

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of ...