Este trabajo fue apoyado por becas-R01 HL87290, R01-S1-HL87290 y R01-AI082610 de los Institutos Nacionales de Salud para LJMC.

1. Craneotomía Una craneotomía en ratones de 8 a 10 semanas de edad se debe realizar con antelación como se describió anteriormente 1, excepto que una barra de titanio no se coloca en la cabeza del animal. La ventana craneal crónica es un examen que permite la preparación estable de la microcirculación pial incluso meses después de ser implantado. Por lo general, realizamos nuestros estudios de 2-3 semanas después de la implantación ventana craneal. 2. Microscopia intravital <ol><li> Dos o tres semanas después de la craneotomía, la temperatura del cuerpo se comprueba y luego el ratón es ligeramente anestesiados con isoflurano (4% para la inducción, 2.1% para el mantenimiento). Ligera anestesia se utiliza para prevenir el estrés del animal y el malestar durante el procedimiento experimental. </li><li> Los animales se colocan en posición de decúbito prono sobre un marco estereotáxico y la cabeza cuidadosamente asegurados con barras de oído. El nivel se ajusta con la palanca derecha e izquierda. La temperatura corporal se mantiene utilizando una almohadilla caliente. Debido a que los ratones con paludismo cerebral desarrolla hipotermia, los ajustes de temperatura deben ser ajustados para cada animal. </li><li> La hoja de la cubierta de la ventana del cráneo es ligeramente limpiarse con un algodón humedecido con aceite mineral y una imagen panorámica de los vasos debajo de la ventana se realiza con la ayuda de un microscopio estereoscópico y una cámara digital (Nikon Coolpix 995, Japón). La fotografía se imprime, identificado y fechado, y será utilizado como un mapa de las mediciones del diámetro del vaso y el rojo la velocidad de células sanguíneas (glóbulos rojos). </li><li> El ratón se transfiere a una platina del microscopio intravital (a la medida de Leica McBain, San Diego, CA). Una gota de agua se coloca en la ventana del cráneo aprovechando la bien formada por el acrílico dental, el enfoque se ajusta. Las mediciones se realizan utilizando un objetivo de inmersión en agua 20 veces (LUMPFL-WIR, apertura numérica de 0,6, Olympus). Los vasos se siguen las mismas por lo que las comparaciones directas de sus niveles de referencia se puede realizar teniendo en cuenta estadísticas más robustas para las poblaciones de la muestra. Las imágenes se capturaron con una cámara digital de baja iluminación de alta velocidad (Hamamatsu C9300-221, Japón), o cámara baja analógica luz (COHU 4815, San Diego, CA) conectado a una cinta de vídeo (JVC, Japón), una marca de tiempo (Video MicroImage sistemas, Boyertown, PA) y un monitor de color (Pelco, Clovis, CA). La cinta se identifica apropiadamente antes de comenzar la grabación, y la marca de tiempo permite la identificación de los acontecimientos mediante la documentación del período de tiempo durante el cual estos eventos fueron recodificados. </li><li> Un primer cheque de los vasos se hace para evaluar la calidad de la preparación y si la sangre fluye en todos los buques. Entonces, la selección de los vasos que se mide se hace y debe incluir las vénulas y arteriolas de diferentes diámetros (en los preparativos del ratón pial, la mayoría de los barcos oscila entre 20 y 80μm) y cubrir diferentes ubicaciones dentro de la zona expuesta por la ventana. Las arteriolas y vénulas se pueden distinguir fácilmente por el control de la dirección del flujo sanguíneo en las ramificaciones de la nave (si se distribuye o se acumula la sangre). En nuestros estudios, las mediciones se realizan en 12 buques. Ubicación exacta de cada punto a medir está anotado en la imagen de la vasculatura pial. </li><li> Para cada punto, el diámetro de los vasos se mide utilizando un dispositivo de corte de la imagen (corte de la imagen, Vista Electronics, San Diego, CA) 2. Una vez que el lugar se selecciona, la imagen de la nave está alineada en posición vertical y la imagen se corta hasta que el extremo opuesto están alineados y la lectura está documentado. Este valor se puede traducir en micrómetros de calibración previa para cada aumento específico utilizando un micrómetro de calibración etapa del retículo (Edmund Optics Inc., Barrington, NJ). </li><li> Cada punto se registra durante al menos 30 segundos para el seguimiento de los eritrocitos. Para el seguimiento de una muestra de sangre se recogen, y los eritrocitos son marcados con fluorescencia con el colorante carbocyanine Dil (Molecular Probes, Carlsbad, CA) y se infunde a través de la vena de la cola para obtener una concentración in vivo de ~ 0.4-0.5% 3. En los animales infectados con Plasmodium berghei ANKA (PBA) que expresa la proteína verde fluorescente (GFP PBA-, una donación de la investigación de la malaria y el reactivo de referencia del Centro de Recursos MR4, Manassas, VA; depositados por CJ Janse y Aguas AP), no la infusión de etiquetado celular es necesario. Las imágenes se graban a 150 fotogramas por segundo. Esta tasa se fija para obtener desde una hasta seis imágenes de una célula en un fotograma de vídeo para la determinación de las velocidades de hasta 8 mm / s. Las imágenes de video son digitalizadas con un ordenador personal utilizando el software Adobe Premier 4.0, y los datos de coordenadas xy para cada imagen de células se han obtenido utilizando SigmaScan Pro 4.0 (SPSS Chicago, IL) 4. Puestos de células se determinan de forma manual en lugar de por análisis de imagen, dado que el ojo de un observador entrenado se muestra para dar una buena estimación de la ubicación del centro de una celda, queh, en general, corresponde a la ubicación de la fluorescencia máxima observada para la mayoría de las orientaciones de la célula. Múltiples determinaciones de posición y velocidad se hacen para cada celda y se promedian para obtener la velocidad media de glóbulos rojos. </li><li> Cuando las mediciones de la velocidad de RBC se realizan en línea, el tiempo total de observación para cada ratón no sea superior a 10-15 minutos para minimizar los efectos de la anestesia cardiodepressive. </li><li> Una vez que el diámetro del vaso y las mediciones de la velocidad de RBC están disponibles, el cálculo del flujo de sangre en cada buque puede hacerse mediante la fórmula: Q = V x π (D / 2) 2, donde Q = flujo de la sangre, V = velocidad de glóbulos rojos y D = diámetro de los vasos. </li><li> Estos procedimientos pueden ser repetidas en el tiempo. Por ejemplo, en el modelo de ratón de malaria cerebral, llevamos a cabo mediciones diarias a partir del día 4 de la infección. Los valores obtenidos cada día para cada ratón se normalizan en relación con el día 0 (pre-infección), que se considera 100%. </li><li> Además de diámetro de los vasos y las mediciones del flujo sanguíneo, las evaluaciones adicionales se puede realizar, por ejemplo, la evaluación de la mejora de la perfusión y el análisis de los leucocitos de rodadura y / o plaquetas y la adhesión en los vasos pial. Estas mediciones se realizan con la ayuda de marcadores fluorescentes con etiqueta. En el caso de la malaria, también podemos detectar que circulan o parásitos adheridos mediante el uso de la cepa PbA que expresa GFP. </li><li> Para la evaluación de la perfusión se utiliza una solución de albúmina marcada con FITC (Sigma, St Louis, MO 50μg/mouse), y para cuantificar la adhesión de leucocitos a los vasos pial usamos anticuerpos contra el marcador pan-leucocitario CD45 marcado con Texas Red (TxR) ( Invitrogen, Carlsbad, CA 4μg/mouse). Para ello, 25μL de la albúmina-FITC (2mg/ml) y 20μL de los anticuerpos anti-CD45-PE (200μg/mL) se mezclan y se inyectan en la vena de la cola pre-calentado. El ratón se pueden crear imágenes de forma inmediata, sin embargo, si las mediciones de las fugas se llevará a la albúmina-FITC se les permite circular durante 15 minutos. De fluorescencia verde (518nm) emitida por la albúmina-FITC y GFP (PBA-GFP GRI) es capturado con Vivid y ALPHA: XF100-2 (Omega Optical, Brattleboro, VT), y anti-CD45 TxR de fluorescencia (615nm) y se sale capturadas con una norma Vivid: XF42. </li><li> La albúmina marcadas con fluorescencia permite una mejor visualización de la red vascular, incluyendo vasos penetrantes, y es particularmente útil en estados de enfermedad como la malaria cerebral para comprobar si los buques no perfundidos o en perfusión. También se puede utilizar para medir la permeabilidad vascular 5. </li><li> El marcado con fluorescencia de anticuerpos anti-CD45 que sea fácil de identificar y cuantificar los leucocitos de rodadura y la adherencia a los buques de pial. Para evitar sesgos en la cuantificación, se cuantifica la rodadura y la adherencia en los mismos lugares pre-definidos para medir el flujo sanguíneo. La cuantificación de la adhesión de los leucocitos se hace contando el número de leucocitos en una longitud de 100μm de los vasos. Rolling se cuantificó contando el número de leucocitos que viajan a una velocidad significativamente más lenta que la velocidad de la sangre en la longitud de 100μm mismo, durante 30 segundos. </li></ol> 3. Los resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. (Paso 2.6) Fotos de la red vascular del ratón pial accesible a través de la ventana del cráneo. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. (Pasos 3.1 a 3.5) Esquema de visualización de la puesta en marcha de microscopía intravital de la microcirculación del ratón pial. 1: microscopio intravital; 2: 20X objetivo de inmersión en agua; 3: fuente de luz; 4a: digital de baja iluminación de alta velocidad de la cámara; 4b: cámara analógica, 5: del ratón en el marco estereotáxico, 6: monitor de la computadora; 7: analógico Shearer monitor que muestra cómo la esquila de la imagen (flecha) se realiza para medir el diámetro del vaso. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. (Paso 3.6 a 3.8) microvascular de células rojas de la sangre las mediciones de velocidad mediante el seguimiento de la célula a partir de grabaciones de vídeo de alta velocidad de fluorescencia. Fotos de A a F son imágenes de la secuencia de un barco pial, mostrando una sola RBC en movimiento cruzando el campo delimitado por la cámara microscópica. La medición manual del marco de las posiciones de cuadro de 15 o más células de cruzar el campo, con su distancia pre-calibrado, permite calcular la velocidad media de glóbulos rojos en cada buque con la ayuda de una hoja de cálculo Excel. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. (Paso 3.9) Los datos de un experimento representativo que muestra los cambios en el flujo sanguíneo pial en el tiempo de Plasmodium berghei ANKA (PBA), los ratones infectados (n = 5) y en el control de ratones no infectados (n = 5). Mientras que en los ratones de control del flujo de sangre pial es relativamente estable en el tiempo, la PBA ratones infectados muestran una marcada disminución en el flujo sanguíneoen el momento del desarrollo de la malaria cerebral (día 6). Los datos son la media ± SEM. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. (Paso 4.3) Un gran número de leucocitos adheridos a los vasos pial de un ratón infectado con Plasmodium berghei ANKA, según lo revelado por tinción con anti-CD45-Texas Red anticuerpos fluorescentes.

<ol>
	<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (15), (2008).</li><li>Intaglietta, M., Tompkins, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+measurements+by+video+image+shearing+and+splitting.">Microvascular measurements by video image shearing and splitting.</a> Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).</li><li>Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+displacement+of+red+blood+cells+during+hemodilution+and+the+effect+on+arteriolar+oxygen+profile.">Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).</li><li>Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+erythrocyte+aggregate+size+and+flow+rate+in+skeletal+muscle+venules.">Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).</li><li>Baldwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+hemoglobins+produce+venular+interendothelial+gaps+and+albumin+leakage+in+the+rat+mesentery.">Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).</li><li>Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+cerebral+malaria+is+associated+with+a+vasospasm-like+microcirculatory+dysfunction,+and+survival+upon+rescue+treatment+is+markedly+increased+by+nimodipine.">Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine.</a> Am. J. Pathol. 176 (3), 1306-1315 (2010).</li></ol>

El método de microscopía intravital aquí descrito proporciona una herramienta única y poderosa para la observación detallada de la microcirculación pial en el ratón. Permite singularizar a las arteriolas y vénulas individuales y medir los cambios de una serie de parámetros tales como los diámetros de vasos, las velocidades de RBC, el flujo sanguíneo, la adherencia y la rodadura de los leucocitos, plaquetas y otros elementos de la sangre, la pérdida vascular, el pH del tejido y la pO2 y muchos otros posibles ...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>FDG9623</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbocyanine dye Dil </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>D306</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin-FITC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A9771</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-CD45-TxR Ab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>MCD4517</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P. berghei ANKA-GFP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MR4</td>
<td>MRA-865</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

intravital microscopy of the mouse brain microcirculation using a closed cranial window

Este modelo experimental fue diseñado para evaluar la microcirculación del ratón pial en aguda y crónica, hemodinámicos fisiológicos y fisiopatológicos, las enfermedades inflamatorias y metabólicas, el uso de microscopía de fluorescencia in vivo. Una ventana craneal cerrado se coloca sobre la izquierda parieto-occipital la corteza de los ratones. Microcirculación local se registra en tiempo real a través de la ventana con epi e iluminación de fluorescencia, y las mediciones de los diámetros de los vasos y de glóbulos rojos (RBC) velocidades se llevan a cabo. RBC velocidad se mide en tiempo real mediante la correlación cruzada y / o hematíes marcadas con fluorescencia. Adhesión de leucocitos y plaquetas a los vasos piales y la evaluación de la perfusión y la permeabilidad vascular se realizan con la ayuda de los marcadores de fluorescencia etiquetados, como los anticuerpos albúmina-FITC y anti-CD45 TxR. Microcirculación pueden ser grabados en vídeo varias veces durante varios días. Se utilizó por primera vez la ventana de microscopía intravital cerca del cerebro para estudiar la microcirculación pial para seguir los cambios dinámicos en el curso de la infección por Plasmodium berghei ANKA en ratones y muestran que la expresión de la CM se asocia con trastornos de la microcirculación se caracteriza por la vasoconstricción, la profunda disminución de la sangre el flujo vascular y eventualmente colapsar.

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Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Microscopia intravital para seguir los acontecimientos hemodinámicos e inflamatorios temporal y espacial en la microcirculación pial.

Microscopia intravital de la microcirculación del cerebro del ratón con una ventana craneal cerrado

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

intravital-microscopy-mouse-brain-microcirculation-using-closed

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.3K vistas.  University of California, San Diego. Microscopia intravital para seguir los acontecimientos hemodinámicos e inflamatorios temporal y espacial en la microcirculación pial.

Video: Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Preparación del tejido de cerebro de ratón para inmunomicroscopía

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Investigación

Neurociencias

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Un pulido y reforzado Diluido cráneo-Ventana para a largo plazo de imágenes del cerebro de ratón

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Microscopía Multiphoton de cerebro de ratón Borrado Expresando YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents the return of fear. Pavlovian fear-conditioning paradigms are commonly employed to create a controlled, novel fear association in the laboratory. After pairing an innocuous stimulus (conditioned stimulus, CS) with an aversive outcome (unconditioned stimulus, US) we can elicit a fear response (conditioned response, or CR) by presenting just the stimulus alone1,2 . Once fear is acquired, it can be diminished using extinction training, whereby the conditioned stimulus is repeatedly presented without the aversive outcome until fear is no longer expressed3. This inhibitory learning creates a new, safe representation for the CS, which competes for expression with the original fear memory4. Although extinction is effective at inhibiting fear, it is not permanent. Fear can spontaneously recover with the passage of time. Exposure to stress or returning to the context of initial learning can also cause fear to resurface3,4.
Our protocol addresses the transient nature of extinction by targeting the reconsolidation window to modify emotional memory in a more permanent manner. Ample evidence suggests that reactivating a consolidated memory returns it to a labile state, during which the memory is again susceptible to interference5-9. This window of opportunity appears to open shortly after reactivation and close approximately 6hrs later5,11,16, although this may vary depending on the strength and age of the memory15. By allowing new information to incorporate into the original memory trace, this memory may be updated as it reconsolidates10,11. Studies involving non-human animals have successfully blocked the expression of fear memory by introducing pharmacological manipulations within the reconsolidation window, however, most agents used are either toxic to humans or show equivocal effects when used in human studies12-14. Our protocol addresses these challenges by offering an effective, yet non-invasive, behavioral manipulation that is safe for humans.
By prompting fear memory retrieval prior to extinction, we essentially trigger the reconsolidation process, allowing new safety information (i.e., extinction) to be incorporated while the fear memory is still susceptible to interference. A recent study employing this behavioral manipulation in rats has successfully blocked fear memory using these temporal parameters11. Additional studies in humans have demonstrated that introducing new information after the retrieval of previously consolidated motor16, episodic17, or declarative18 memories leads to interference with the original memory trace14. We outline below a novel protocol used to block fear recovery in humans.

Conditioned fear can be diminished through an inhibitory process called extinction, but can resurface under conditions such as the passage of time or exposure to stress. Our protocol presents a novel way of preventing fear recovery by introducing extinction during the reconsolidation window (the re-storage phase of a reactivated memory).

Formación extinción durante la ventana de reconsolidación impide una recuperación del Miedo

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

El sistema olfativo como un modelo para estudiar los patrones de crecimiento axonal y Morfología<em&gt; En Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies using Drosophila have contributed important breakthroughs in understanding neurological processes. Thus, with the goal of understanding the cellular and molecular basis of TBI pathologies in humans, we developed the High Impact Trauma (HIT) device to inflict closed head TBI in flies. Flies subjected to the HIT device display phenotypes consistent with human TBI such as temporary incapacitation and progressive neurodegeneration. The HIT device uses a spring-based mechanism to propel flies against the wall of a vial, causing mechanical damage to the fly brain. The device is inexpensive and easy to construct, its operation is simple and rapid, and it produces reproducible results. Consequently, the HIT device can be combined with existing experimental tools and techniques for flies to address fundamental questions about TBI that can lead to the development of diagnostics and treatments for TBI. In particular, the HIT device can be used to perform large-scale genetic screens to understand the genetic basis of TBI pathologies.

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Here we describe a method to inflict closed head traumatic brain injury (TBI) in Drosophila. This method provides a gateway to investigate the cellular and molecular mechanisms that underlie TBI pathologies using the vast array of experimental tools and techniques available for flies.

Un método para infligir Cerrado Jefe lesión cerebral traumática en<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated thinning of the skull. Cranial window surgery is typically performed with a high speed rotary drill, and many investigators find it challenging to prevent the drill from damaging the delicate dura and blood vessels. Extensive training and practice is required to remove the bone without damage to underlying tissue and thus cranial window surgery can be difficult, time consuming, and produce tissue damage. Piezoelectric surgery, which is extensively used for maxillofacial and dental surgery, utilizes ultrasonic vibrations to remove bone without damaging soft tissues. We have developed a method applying piezoelectric surgery to improve cranial window surgery in mice in preparation for multiphoton imaging. Comparisons within our lab find that the method requires less surgery time and has a lower average rate of complications due to dural bleeding than cranial window surgery with a rotary drill.

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezoelectric surgery has led to improvements in human maxillofacial and dental surgery. We have developed a protocol to optimize piezoelectric surgery for cranial window surgery in mice.

Piezoeléctrico de alta precisión ósea la extirpación quirúrgica (fasor): Una técnica mejorada ventana craneal cirugía en ratones

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminectomía e implantación de la ventana de la médula espinal en el ratón

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

Cuantificar la distribución heterogénea de una proteína sináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Methods Article

Microscopia intravital de la microcirculación del cerebro del ratón con una ventana craneal cerrado