Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni R01-HL87290, R01-HL87290-S1 e R01-AI082610 dal National Institutes of Health di LJMC.

1. Craniotomia Un craniotomia a 8-a-10-settimana topi vecchi deve essere eseguita in anticipo come descritto in precedenza 1, tranne che una barra di titanio non si trova nella testa dell&#39;animale. La finestra cronica cranica è un esame che consente la preparazione stabile della microcircolazione piale anche mesi dopo essere stato impiantato. Di solito, noi dobbiamo fare i nostri studi 2-3 settimane dopo l&#39;impianto finestra cranica. 2. Microscopia intravitale <ol><li> Due-tre settimane dopo la craniotomia, la temperatura corporea è controllata e poi il mouse è leggermente anestetizzati con isoflurano (4% per l&#39;induzione, 1-2% per la manutenzione). Anestesia luce è utilizzato per prevenire lo stress degli animali e il disagio durante la procedura sperimentale. </li><li> Gli animali vengono poi poste in posizione prona su un telaio stereotassico e la testa accuratamente protetti utilizzando le barre orecchio. Il livello è regolato con le leve destra e sinistra. Temperatura corporea viene mantenuta con una piastra elettrica. Poiché i topi con malaria cerebrale sviluppano ipotermia, le impostazioni di temperatura devono essere adeguate per ogni animale. </li><li> Lo slittamento di copertura sulla finestra cranica è delicatamente pulito con un batuffolo di cotone imbevuto di olio minerale e una foto panoramica dei vasi sotto la finestra è presa con l&#39;aiuto di uno stereomicroscopio e una macchina fotografica digitale (Nikon Coolpix 995, Giappone). L&#39;immagine è stampata, identificato e datato e sarà utilizzata come una mappa per le misure del diametro del vaso e di globuli rossi (RBC) velocità. </li><li> Il mouse è poi trasferito in una fase microscopio intravitale (personalizzato Leica-McBain, San Diego, CA). Una goccia d&#39;acqua è posizionato sulla finestra cranica approfittando della ben formata dal acrilico dentale, messa a fuoco viene regolata. Misurazioni sono effettuate utilizzando un 20X (LUMPFL-WIR, apertura numerica 0.6, Olympus) obiettivo immersione in acqua. Le stesse navi sono seguite in modo che i confronti diretti ai loro livelli basali è stato possibile effettuare, permettendo un maggiore statistiche robuste per le popolazioni piccolo campione. Le immagini vengono catturate con una macchina fotografica digitale a bassa velocità della luce (Hamamatsu C9300-221, in Giappone), o bassa telecamera analogica luce (Cohu 4815, San Diego, CA) collegato ad un nastro videoregistratore (JVC, Giappone), di data e ora (Video MicroImage sistemi, Boyertown, PA) e un monitor a colori (PELCO, Clovis, CA). Il nastro è correttamente identificati prima dell&#39;inizio della registrazione, e il timestamp permette l&#39;identificazione degli eventi documentando il periodo di tempo durante il quale sono stati ricodificato tali eventi. </li><li> Un primo controllo dei vasi è fatto per valutare la qualità della preparazione e se il sangue scorre in tutte le navi. Poi, la selezione dei vasi da misurare è fatto e dovrebbe includere venule e arteriole di diametri diversi (nel nostro preparati topo piale, maggior parte delle navi comprese tra 20 e 80μm) e coprono diverse posizioni all&#39;interno della superficie esposta alla finestra. Arteriole e venule possono essere facilmente differenziate controllando la direzione del flusso di sangue nel ramificazioni della nave (se distribuisce o raccoglie il sangue). Nei nostri studi, le misure sono effettuate in 12 unità. Posizione precisa di ogni punto da misurare è annotato nel quadro della vascolarizzazione piale. </li><li> Per ogni spot, il diametro del vaso è misurata utilizzando un dispositivo di taglio dell&#39;immagine (taglio immagine, Vista Elettronica, San Diego, CA) 2. Una volta che il luogo è selezionata, l&#39;immagine della nave è allineato in posizione verticale e l&#39;immagine viene tosato fino agli estremi opposti sono allineati e la lettura è documentata. Questo valore può essere tradotto in micrometri da precedente calibrazione per ogni ingrandimento specifico utilizzando un reticolo micrometrico di taratura (Edmund Optics Inc., Barrington, New Jersey). </li><li> Ogni spot è registrato durante almeno 30 secondi per il monitoraggio degli eritrociti. Per l&#39;inseguimento, un campione di sangue viene raccolto, ed eritrociti sono marcate con il colorante carbocyanine Dil (Molecular Probes, Carlsbad, CA) e infuso attraverso la vena della coda per ottenere un concentrazioni in vivo di circa 0.4-0.5% 3. Negli animali infettati da Plasmodium berghei ANKA (PBA) che esprime la proteina fluorescente verde (GFP-PBA, una donazione dalla ricerca sulla malaria e di riferimento reagente Resource Center MR4, Manassas, VA; depositati da CJ Janse e AP Waters), nessuna infusione di etichetta cella è necessario. Le immagini video sono registrati a 150 fotogrammi al secondo. Questo tasso è impostato per ottenere 1-6 immagini di una cella su un fotogramma del video per la determinazione delle velocità fino a 8 mm / s. Le immagini video sono digitalizzati con un personal computer utilizzando il software Adobe Premiere 4.0 e xy dati di coordinate per ogni immagine cellulari ottenute utilizzando SigmaScan Pro 4.0 software (SPSS Chicago, IL) 4. Posizioni delle cellule sono determinate manualmente piuttosto che da analisi d&#39;immagine, dato che l&#39;occhio di un osservatore addestrato ha dimostrato di dare una buona stima della posizione del centro di una cellula, cheh, in generale, corrisponde alla posizione di fluorescenza massima osservato per la maggior parte delle cellule orientamenti. Determinazioni multiple di posizione e velocità sono fatti per ogni cella e una media di ottenere velocità media dei globuli rossi. </li><li> Quando misure di velocità dei globuli rossi vengono eseguite in linea, il tempo di osservazione totale per ogni mouse non sia superiore a 10-15 minuti cardiodepressive minimizzare gli effetti dell&#39;anestesia. </li><li> Una volta diametro del vaso e misure della velocità di RBC sono disponibili, il calcolo del flusso sanguigno in ogni nave può essere fatto utilizzando la formula: Q = V x π (D / 2) 2, dove Q = flusso di sangue, V = velocità dei globuli rossi e D = diametro del vaso. </li><li> Queste procedure possono essere ripetute nel tempo. Per esempio, nel modello murino della malaria cerebrale, eseguiamo misurazioni giornaliere a partire dal giorno 4 di infezione. I valori ottenuti ogni giorno per ogni mouse sono normalizzati rispetto al giorno 0 (pre-infezione), che è considerato al 100%. </li><li> Oltre al diametro del vaso e le misurazioni del flusso sanguigno, le valutazioni aggiuntive possono essere eseguite, per esempio una migliore valutazione della perfusione e l&#39;analisi di rotolamento dei leucociti e / o piastrine e l&#39;aderenza in vasi piale. Queste misurazioni sono effettuate con l&#39;ausilio di marcatori fluorescenti-etichettati. Nel caso della malaria, si può anche rilevare in circolazione o parassiti aderenti mediante utilizzando il ceppo PBA che esprime GFP. </li><li> Per la valutazione della perfusione usiamo una soluzione di albumina marcato con FITC (Sigma, St Louis, MO 50μg/mouse), e per quantificare l&#39;adesione dei leucociti alle navi piale si usa anticorpi contro il pan-leucociti marcatore CD45 marcati con Texas Red (TXR) ( Invitrogen, Carlsbad, CA 4μg/mouse). Per questo, 25μL del Albumina-FITC (2mg/ml) e 20μL del movimento anti-CD45-PE anticorpi (200μg/mL) sono miscelati e iniettati nel pre-riscaldato vena della coda. Il mouse può essere ripreso immediatamente, se le misure di dispersione si albumina-FITC è consentito di circolare per 15 minuti. Fluorescenza verde (518nm) emessa da albumina-FITC e GFP (PBA-GFP pRBC) viene catturata usando e ALPHA Vivid: XF100-2 (Omega Optical, Brattleboro, VT), e anti-CD45-TXR fluorescenza (615nm) viene chiuso e catturato con un Vivid standard: XF42. </li><li> La fluorescenza marcata albumina permette una migliore visualizzazione della rete vascolare, comprese le navi penetrante, ed è particolarmente utile negli stati di malattia come la malaria cerebrale per verificare per le navi non perfuso o sotto-perfusi. Può anche essere utilizzato per misurare la perdita vascolare 5. </li><li> Il fluorescente marcato anticorpi anti-CD45 lo rendono facile da identificare e quantificare rotolamento dei leucociti e l&#39;adesione alle navi piale. Per evitare distorsioni nella quantificazione, si quantificare rotolamento e adesione sugli stessi punti predefiniti per misurare il flusso sanguigno. Quantificazione di adesione dei leucociti è fatto contando il numero di leucociti in una nave-100μm lunghezza. Rotolamento è quantificato contando il numero di leucociti viaggia a una velocità notevolmente più lento di velocità del sangue nella stessa lunghezza 100μm, per 30 secondi. </li></ol> 3. Rappresentante risultati <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. (Punto 2.6) Immagini della rete piale vascolare del mouse accessibile attraverso la finestra del cranio. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. (Piazza di 3,1-3,5) visualizzare schematica del set up per la microscopia intravitale del microcircolo del mouse piale. 1: intravitale microscopio; 2: 20X obiettivo immersione in acqua; 3: sorgente di luce; 4a: digitale di scarsa illuminazione telecamera ad alta velocità; 4b: telecamera analogica; 5: il mouse nel frame stereotassico; 6: monitor del computer; 7: analogico tosatore Monitor che mostra come la tosatura immagine (freccia) viene fatto per misurare diametro del vaso. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. (Passo 3,6-3,8) microvascolari rosso sangue velocità misurazioni delle cellule tenendo traccia delle cellule di registrazioni video ad alta velocità fluorescenza. Foto da A a F sono immagini sequenza di una nave piale, mostrando un singolo RBC in movimento che attraversano il campo microscopico delimitata dalla fotocamera. Determinazione manuale del fotogramma per fotogramma posizioni di 15 o più celle che attraversano il campo, con la sua distanza pre-calibrato, permette il calcolo della velocità media dei globuli rossi in ogni nave con l&#39;aiuto di un foglio di calcolo Excel. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. (Punto 3.9) dei dati di un esperimento rappresentativo che mostra i cambiamenti del flusso sanguigno piale nel tempo in Plasmodium berghei ANKA (PBA) topi infettati (n = 5) e in topi di controllo non infetto (n = 5). Mentre in topi di controllo del flusso di sangue piale è relativamente stabile nel tempo, PBA topi infettati mostrano una marcata diminuzione del flusso sanguignoal momento dello sviluppo della malaria cerebrale (giorno 6). I dati sono la media ± SEM. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. (Step 4.3) Un gran numero di leucociti aderenti alle navi piale di un topo infettati da Plasmodium berghei ANKA, come rivelato dalla colorazione con anticorpi anti-CD45-Texas Red anticorpi fluorescenti.

<ol>
	<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (15), (2008).</li><li>Intaglietta, M., Tompkins, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+measurements+by+video+image+shearing+and+splitting.">Microvascular measurements by video image shearing and splitting.</a> Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).</li><li>Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+displacement+of+red+blood+cells+during+hemodilution+and+the+effect+on+arteriolar+oxygen+profile.">Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).</li><li>Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+erythrocyte+aggregate+size+and+flow+rate+in+skeletal+muscle+venules.">Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).</li><li>Baldwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+hemoglobins+produce+venular+interendothelial+gaps+and+albumin+leakage+in+the+rat+mesentery.">Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).</li><li>Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+cerebral+malaria+is+associated+with+a+vasospasm-like+microcirculatory+dysfunction,+and+survival+upon+rescue+treatment+is+markedly+increased+by+nimodipine.">Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine.</a> Am. J. Pathol. 176 (3), 1306-1315 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo di microscopia intravitale qui descritto fornisce uno strumento unico e potente per l&#39;osservazione dettagliata del microcircolo piale nel topo. Permette individuando singole arteriole e venule e misurare i cambiamenti di un certo numero di parametri quali diametro nave, velocità dei globuli rossi, il flusso di sangue, aderenza e rotolamento dei leucociti, piastrine e altri elementi del sangue, fuoriuscita vascolare, pH tessutale e pO2 e potenzialmente molti altri applicazioni. La risposta vascolare in...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>FDG9623</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbocyanine dye Dil </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>D306</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin-FITC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A9771</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-CD45-TxR Ab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>MCD4517</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P. berghei ANKA-GFP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MR4</td>
<td>MRA-865</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

intravital microscopy of the mouse brain microcirculation using a closed cranial window

Questo modello sperimentale è stato disegnato per valutare la microcircolazione piale mouse durante acute e croniche, emodinamica fisiologico e fisiopatologico, stati infiammatori e metabolici, utilizzando in vivo microscopia a fluorescenza. Una finestra chiusa del cranio è posta sopra la sinistra corteccia parieto-occipitale dei topi. Microcircolazione locale è registrato in tempo reale attraverso la finestra utilizzando epi e illuminazione a fluorescenza, e le misure di diametri navi e dei globuli rossi (RBC) velocità vengono eseguiti. RBC velocità viene misurata utilizzando in tempo reale cross-correlazione e / o eritrociti fluorescente-etichettati. L&#39;adesione dei leucociti e delle piastrine alle navi piale e valutazione della perfusione vascolare e perdite sono realizzati con l&#39;aiuto di marcatori di fluorescenza marcati come gli anticorpi albumina-FITC e anti-CD45-TXR. Microcircolazione possono essere ripetutamente il video-registrato per diversi giorni. Abbiamo usato per la prima volta alla chiusura microscopia cervello finestra intravitale per studiare il microcircolo piale di seguire i cambiamenti dinamici nel corso di infezione da Plasmodium berghei ANKA nei topi e mostrano che l&#39;espressione di CM è associata a disfunzioni del microcircolo caratterizzata da vasocostrizione, marcata diminuzione nel sangue flusso e alla fine il collasso vascolare.

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Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Microscopia intravitale di seguire gli eventi emodinamici infiammatori e temporale e spaziale del microcircolo piale.

Microscopia intravitale della microcircolazione cervello di topo usando una finestra chiusa del cranio

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

intravital-microscopy-mouse-brain-microcirculation-using-closed

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.3K Views.  University of California, San Diego. Microscopia intravitale di seguire gli eventi emodinamici infiammatori e temporale e spaziale del microcircolo piale.

Video: Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Preparazione del tessuto cerebrale del mouse per la microscopia Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Ricerca

Neuroscienze

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Un lucido e rinforzato Assottigliato cranio-Window a lungo termine Imaging del cervello di topo

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Microscopia Multiphoton di cervello di topo Cancellato Esprimere YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents the return of fear. Pavlovian fear-conditioning paradigms are commonly employed to create a controlled, novel fear association in the laboratory. After pairing an innocuous stimulus (conditioned stimulus, CS) with an aversive outcome (unconditioned stimulus, US) we can elicit a fear response (conditioned response, or CR) by presenting just the stimulus alone1,2 . Once fear is acquired, it can be diminished using extinction training, whereby the conditioned stimulus is repeatedly presented without the aversive outcome until fear is no longer expressed3. This inhibitory learning creates a new, safe representation for the CS, which competes for expression with the original fear memory4. Although extinction is effective at inhibiting fear, it is not permanent. Fear can spontaneously recover with the passage of time. Exposure to stress or returning to the context of initial learning can also cause fear to resurface3,4.
Our protocol addresses the transient nature of extinction by targeting the reconsolidation window to modify emotional memory in a more permanent manner. Ample evidence suggests that reactivating a consolidated memory returns it to a labile state, during which the memory is again susceptible to interference5-9. This window of opportunity appears to open shortly after reactivation and close approximately 6hrs later5,11,16, although this may vary depending on the strength and age of the memory15. By allowing new information to incorporate into the original memory trace, this memory may be updated as it reconsolidates10,11. Studies involving non-human animals have successfully blocked the expression of fear memory by introducing pharmacological manipulations within the reconsolidation window, however, most agents used are either toxic to humans or show equivocal effects when used in human studies12-14. Our protocol addresses these challenges by offering an effective, yet non-invasive, behavioral manipulation that is safe for humans.
By prompting fear memory retrieval prior to extinction, we essentially trigger the reconsolidation process, allowing new safety information (i.e., extinction) to be incorporated while the fear memory is still susceptible to interference. A recent study employing this behavioral manipulation in rats has successfully blocked fear memory using these temporal parameters11. Additional studies in humans have demonstrated that introducing new information after the retrieval of previously consolidated motor16, episodic17, or declarative18 memories leads to interference with the original memory trace14. We outline below a novel protocol used to block fear recovery in humans.

Conditioned fear can be diminished through an inhibitory process called extinction, but can resurface under conditions such as the passage of time or exposure to stress. Our protocol presents a novel way of preventing fear recovery by introducing extinction during the reconsolidation window (the re-storage phase of a reactivated memory).

Formazione estinzione durante la finestra di riconsolidamento impedisce il recupero della paura

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Il sistema olfattivo come modello per studiare gli schemi di crescita assonale e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

Closed-loop di esperimenti neuro-robotica a prova le proprietà computazionali di neuronali Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies using Drosophila have contributed important breakthroughs in understanding neurological processes. Thus, with the goal of understanding the cellular and molecular basis of TBI pathologies in humans, we developed the High Impact Trauma (HIT) device to inflict closed head TBI in flies. Flies subjected to the HIT device display phenotypes consistent with human TBI such as temporary incapacitation and progressive neurodegeneration. The HIT device uses a spring-based mechanism to propel flies against the wall of a vial, causing mechanical damage to the fly brain. The device is inexpensive and easy to construct, its operation is simple and rapid, and it produces reproducible results. Consequently, the HIT device can be combined with existing experimental tools and techniques for flies to address fundamental questions about TBI that can lead to the development of diagnostics and treatments for TBI. In particular, the HIT device can be used to perform large-scale genetic screens to understand the genetic basis of TBI pathologies.

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Here we describe a method to inflict closed head traumatic brain injury (TBI) in Drosophila. This method provides a gateway to investigate the cellular and molecular mechanisms that underlie TBI pathologies using the vast array of experimental tools and techniques available for flies.

Un metodo per infliggere Chiuso Testa trauma cranico in<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated thinning of the skull. Cranial window surgery is typically performed with a high speed rotary drill, and many investigators find it challenging to prevent the drill from damaging the delicate dura and blood vessels. Extensive training and practice is required to remove the bone without damage to underlying tissue and thus cranial window surgery can be difficult, time consuming, and produce tissue damage. Piezoelectric surgery, which is extensively used for maxillofacial and dental surgery, utilizes ultrasonic vibrations to remove bone without damaging soft tissues. We have developed a method applying piezoelectric surgery to improve cranial window surgery in mice in preparation for multiphoton imaging. Comparisons within our lab find that the method requires less surgery time and has a lower average rate of complications due to dural bleeding than cranial window surgery with a rotary drill.

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezoelectric surgery has led to improvements in human maxillofacial and dental surgery. We have developed a protocol to optimize piezoelectric surgery for cranial window surgery in mice.

Piezo alta precisione d'ossa e la rimozione chirurgica (PHASOR): Una tecnica di chirurgia finestra cranica migliorata in topi

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminectomia e impianto della finestra del cavo spinale nel mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...