Nos gustaría dar las gracias a G. O Toole de orientación y sugerencias en el desarrollo de estos modelos. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Fibrosis Quística (ANDERS06F0 a GGA, STANTO07RO y STANTO08GA a BAS), los Institutos Nacionales de Salud (T32A107363 a GGA y R01-HL074175 a BAS), y el Centro Nacional para Recursos de Investigación Centros de Excelencia para la Investigación Biomédica (P20-COBRE RR018787 a BAS).

1. Estática Co-cultura Biofilm Modelo <ol><li> La estática Co-cultura Modelo Biofilm 1 utiliza CFBE41o las células (células CFBE), que se inmortalizan las células originalmente desarrollado a partir de una persona con FQ homocigotos para la mutación F508-CFTR 2,3,4. CFBE células deben ser sembradas a una concentración de 10 6 células / pocillo en una placa de tejidos de 6 pocillos cultura o 2 x 10 5 en una placa de tejido de 24 pocillos en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con suero fetal bovino al 10%, 2 mM L-glutamina, 50 U / mL de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina. Usamos 1,5 ml de medio por pocillo en placas de 6 pocillos y 0,5 ml de medio por pocillo en placas de 24 pocillos. </li><li> Las células deben ser cultivadas a 37 ° C y 5% CO 2 -95% de aire durante 7-10 días para formar una monocapa antes de la inoculación con bacterias. El medio debe ser cambiado cada 2-3 días. Estas condiciones se ha demostrado que conducen a la formación de una monocapa y uniones estrechas. </li><li> Crecer P. aeruginosa en 5 ml de LB durante 18 horas a 37 ° C en un agitador incubadora a 200 rpm. En estas condiciones, P. culturas aeruginosa típicamente llegar a una densidad de 5x10 9 UFC / mL. </li><li> Para la inoculación de bacterias, se elimina el medio de las células CFBE y añadir un volumen igual de MEM sin rojo fenol, suplementado con 2 mM L-glutamina (medio Microscopía). Monocapas confluentes CFBE son inoculadas con P. aeruginosa a una multiplicidad de infección de aproximadamente 30:1 en relación con el número de células CFBE originalmente sembradas. Esto equivale a 2 x 10 7 UFC / ml en 1,5 ml de MEM / pocillo para placas de 6 pocillos y 1.2 X 10 7 UFC / mL en mL MEM 0,5 / pocillo para placas de 24 pocillos. </li><li> Incubar las placas durante 1 hora a 37 ° C y 5% CO 2 -95% de aire. </li><li> Después de la incubación de 1 hora, el sobrenadante debe ser eliminado y reemplazado por medio fresco Microscopía suplementado con 0,4% de arginina. </li><li> Se incuba a 37 ° C y 5% CO 2 -95% de aire para varios puntos de tiempo (hasta aproximadamente 8 horas) y analizar la integridad de la monocapa CFBE mediante microscopía de contraste de fase. Si las células de las vías respiratorias no son confluentes, P. aeruginosa rápidamente (en minutos) el acceso a la superficie basolateral de las células y destruye la integridad celular. La inoculación con P. aeruginosa que constitutivamente expresar los resultados de las buenas prácticas agrarias en microcolonias biofilm fluorescente que puede ser visualizado por microscopía de epifluorescencia y confocal. </li><li> El UFC de bacterias en el biofilm se puede determinar por el lavado de la co-cultivo 2-3 veces con tampón fosfato salino (PBS) para eliminar las bacterias planctónicas. Tras el lavado, el tratamiento con 0,1% Triton X-100 en PBS o MEM durante 10-15 minutos para lisar las células epiteliales y dispersar el biofilm. </li><li> Vortex durante 3 minutos y preparar diluciones seriadas del lisado. Placa de estas diluciones en agar LB e incubar durante la noche a 37 ° C. Contar las colonias al día siguiente para determinar la UFC. </li></ol> 2. Celda de flujo Co-cultura Biofilm Modelo <ol><li> La celda de flujo Co-cultura Modelo Biofilm (ensayo de flujo) implica la modificación de los aparatos celulares biopelícula de flujo estándar para dar cabida a las células CFBE 5. </li><li> Coloque varios de 40 mm de diámetro cubreobjetos de vidrio en un recipiente limpio de 100 ml vaso. Cubra bien con 2 capas de papel de aluminio y autoclave en un ciclo seco durante 20 minutos. </li><li> Trabajo en una campana de cultivo celular, tomar un cubreobjetos estériles del vaso con las pinzas de etanol lavar y colocar en un recipiente estéril de 60 mm de diámetro plato de plástico. </li><li> Añadir 3 ml de pre-calentado medio de cultivo celular, al pulsar sobre el cubreobjetos con la punta de la pipeta para eliminar cualquier burbuja atrapada debajo y para forzar el portaobjetos en la parte inferior del plato de plástico. </li><li> Semillas de 2x10 6 células por placa y agite suavemente el plato hacia atrás y adelante. Evite el remolino para evitar la centrifugación de las células contra los lados del plato. </li><li> Coloque el plato en un 5% de CO 2 -95% aire de la incubadora a 37 ° C y alimentar las células de cada dos días con 3 ml de medio de cultivo fresco de 8 a 10 días. Las células se forma una monocapa sobre el cubreobjetos. </li><li> Crecer P. aeruginosa en 5 ml de LB durante 18 horas a 37 ° C en un agitador incubadora a 200 rpm. En estas condiciones, P. culturas aeruginosa típicamente llegar a una densidad de 5x10 9 UFC / mL. Usamos P. PAO1 aeruginosa cepa que lleva el plásmido pSMC21 para la expresión constitutiva de GFP 6. </li><li> Añadir 1 ml de cultivo bacteriano en un tubo estéril de microcentrífuga. Centrifugar a 6000 rpm durante 3 minutos, y lavar el sedimento bacteriano en dos ocasiones en 1 ml de medio de microscopía. </li><li> Diluir 0,5 ml de bacterias lavadas y resuspendidas en 4,5 ml de medio de microscopía para lograr una concentración de ~ 5x10 8 UFC / mL. </li><li> La observación de células vivasen tiempo real requiere una cámara de imágenes acoplado a una bomba peristáltica (para asegurar un flujo de nutrientes durante largos períodos de tiempo) y un controlador de temperatura. Usamos la FCS2 Bioptechs (Focht células vivas) la cámara conectada a una bomba de bajo flujo micro-perfusión de 1 / 16 ª C-flex cortar los tubos de longitudes apropiadas y autoclave para esterilización y la temperatura regulada a través del controlador de la cámara FCS2. Nosotros mantenemos la fuente de entrada de medio a 37 ° C baño de agua ubicado justo al lado del microscopio. </li><li> Montar la cámara de flujo. La cámara incluye una base de FCS2 auto-bloqueo (que se encuentra en el adaptador de la etapa durante la exposición) y una mitad superior conectado a los tubos de perfusión y el controlador de la cámara. La cámara se monta al revés antes de que se dio la vuelta y se coloca en el adaptador de la etapa. Mantenga la parte superior de la cámara al revés para que los tubos de perfusión son visibles, y alinear los agujeros de paso de una junta de goma de 0,75 mm de espesor en los tubos de perfusión. Pila de la diapositiva microaqueduct siempre con la cámara en la parte superior de la junta de goma, asegurándose de que la parte acanalada, y colocar otra junta de goma en la parte superior de la diapositiva. El espesor y la geometría interna de esta junta determinará el segundo volumen de la cámara. Por lo general trabajan con una junta de goma de 0,75 mm de espesor con un 30-mm geometría interna y vuelta. </li><li> Añadir 1 ml de pre-calentado (37 ° C) Microscopía medio en el centro de la diapositiva. </li><li> Recuperar un plato de 60 mm desde el cultivo celular incubadora, se elimina el medio gastado y se lavan las células una vez con 3 ml de medio de microscopía de pre-calentado. Este paso asegura la eliminación del rojo fenol y antibióticos presentes en el medio de cultivo celular. Rojo fenol es ligeramente fluorescentes y pueden interferir con la imagen, mientras que los antibióticos pueden eliminar P. aeruginosa antes de que puedan establecer las biopelículas. </li><li> Utilizando lavados con etanol fórceps, recuperar el cubreobjetos del plato y lo baja al revés sobre la gota de medio de Microscopía coloca en la cámara. El cubreobjetos está ahora descansando en la segunda junta de goma y la monocapa de células de las vías respiratorias es hacia abajo. </li><li> La celebración de los componentes montados en una mano, coloque la base de la cámara en la parte superior de la pila y encienda la cámara más rápida para que todo quede al derecho. Bloqueo de la base en lugar de girar el anillo. </li><li> Conecte el tubo de entrada a la corriente de baja micro-perfusión de la bomba e iniciar el flujo a una velocidad de 20 ml / h, este caudal se encuentra dentro de la capacidad de velocidad de nado de P. aeruginosa. Una segunda pieza de tubo de la bomba de enlaces a un matraz de medio de Microscopía coloca en el 37 ° C baño de agua ubicado justo al lado del microscopio. </li><li> Adjuntar estéril pre-corte 1 / 16 de C-Flex tubería a la entrada y salida de los tubos de perfusión de la cámara, conectar el controlador de temperatura, a continuación, coloque la cámara montada en la platina del microscopio de un microscopio de fluorescencia invertido. </li><li> Usando una jeringa desechable de 1 ml, inyectar la suspensión previamente preparada de bacterias en la cámara, usando una válvula de dos vías colocadas en la línea entre la bomba y la cámara. En nuestro contexto particular, se necesita un volumen de 0,6 ml de suspensión bacteriana para llegar a la cámara. Ajustar este volumen de acuerdo a su longitud de la tubería en particular. También nos parece útil colocar un filtro en línea disponible 0,22 micras filtro entre la bomba y la válvula de dos vías para evitar que las bacterias de nadar contra la corriente y la contaminación del frasco de entrada. </li><li> Para permitir que las bacterias se adhieren a las células de las vías respiratorias, detener la bomba de 2h. El flujo puede ser reiniciado y se mantiene a 20 ml / h durante el resto del experimento. </li><li> Supervisar la integridad de las células de las vías respiratorias por el contraste de interferencia diferencial (DIC) de microscopía durante todo el experimento para comprobar si hay señales de daño en la monocapa. Al mismo tiempo, seguir el desarrollo de buenas prácticas agrarias con etiqueta P. biofilms aeruginosa en la superficie apical de las células de las vías respiratorias mediante la adquisición de imágenes con un microscopio de fluorescencia confocal invertido o de campo amplio. </li></ol> 3. Resultados representante Usamos una cepa de P. aeruginosa que contiene el plásmido pSMC21 que permite la expresión constitutiva de GFP 6. Por esta razón, las buenas prácticas agrarias con etiqueta biopelículas que crecen en una monocapa CFBE puede ser visualizado por microscopía de epifluorescencia. Por otra parte, la visualización de la película biológica se puede lograr mediante la tinción etiqueta P. aeruginosa con una solución al 1% calcofluor blanco durante 1 hora a 37 ° C 1. Para la formación de biofilm de imágenes en las células CFBE en el ensayo de flujo, se utiliza un adaptador de etapa a la medida, pero muchas compañías ahora pueden ofrecer adaptadores de etapa especialmente equipados. Trabajamos con una Olympus IX70 microscopio invertido equipado con un ORCA-AG profunda cámara CCD y un enfriamiento de aceite x60 objetivo de inmersión (apertura numérica 1,40). El filtro wtalón está equipado con un filtro de banda 480/40 nm de excitación y pasar a una banda 535/30 nm filtro de emisión pasar. Las imágenes digitales fueron adquiridos con el paquete de software Openlab 4.0.3 (improvisación) y los volúmenes se deconvolved por iterativo restauración utilizando el software 3.5.1 Volocity (Improvisación). El análisis cuantitativo de las estructuras de biofilm en 3D se consiguió con el paquete de software de análisis de imagen COMSTAT 7,8. Para que un modelo de co-cultivo considerado, se debe prestar especial atención a la citotoxicidad de desarrollo entre los componentes del modelo. Tanto en la estática y los ensayos de la celda de flujo, se encontró que la monocapa CFBE podía soportar la presencia de P. aeruginosa de hasta 8 horas después de la inoculación, sin ningún signo de alteración. La integridad de monocapa epitelial puede ser evaluada por microscopía de contraste de fase mediante un microscopio invertido 1 (Figura 1) o por interferencia diferencial de contraste (DIC) de microscopía durante todo el experimento 5. Con el tiempo, P. aeruginosa se ​​producen toxinas y factores de virulencia que se acumulan y pueden dañar la monocapa de células epiteliales en todo o en secciones (Figura 1B-1C). Citotoxicidad puede ser cuantitativamente evaluó a través de varios kits para medir la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) de las células epiteliales. LDH es una enzima citosólica estable liberada en el medio extracelular a la lisis o muerte celular. Cuando la integridad de la monocapa de las vías respiratorias no se ve comprometida (por lo general de ~ 8 h después de la inoculación), P. biofilms aeruginosa con éxito se pueden formar y desarrollar en la superficie apical de las células de las vías respiratorias, tanto en la cultura co-modelos descritos (Figura 2A-2B). Después de la reconstrucción 3D (Figura 2 C) y la cuantificación, la acumulación de biomasa puede determinarse con precisión. También hemos utilizado estos biofilms de co-cultivo en varios ensayos fenotípicos. Por ejemplo, como se mencionó anteriormente, biofilm UFC se puede determinar fácilmente por lisis de las células epiteliales, diluyendo en serie el lisado, y de las planchas en placas de agar. Hemos encontrado que esta técnica ventajosa en la determinación de la resistencia de las cepas a los antibióticos. Además, la toxicidad de biofilm a las células epiteliales se puede medir con equipos disponibles en el mercado de detección de LDH. De esta manera, el papel de los factores de virulencia en la toxicidad de los biofilms pueden ser evaluados. Estos sistemas de modelos también soportan una serie de aplicaciones de la expresión de genes, incluidos los estudios de fusión de promotor, RT-PCR y análisis de microarrays 1,5,9. <img src="/files/ftp_upload/2186/2186fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Monocapa de células CFBE e imágenes representativas de peligro y las vías respiratorias dañadas monocapas de células por P. aeruginosa crecimiento del biofilm. (A) imagen representativa de una monocapa de células cultivadas en placas de CFBE cultivo de tejidos, evaluada por microscopía de contraste de fase. Barra de escala, de 120 micras. (B) Ejemplo de una monocapa CFBE comprometida. A pesar de que la monocapa no muestra signos evidentes de daños visibles, sin embargo, P. aeruginosa son vistos difusión entre las uniones estrechas de las células epiteliales y obtener acceso a las membranas basolateral. La formación de biofilm no suele alcanzar en estas condiciones debido al deterioro de la monocapa. Barra de escala, 20 micras. (C) Ejemplo de una maleza P. biofilm aeruginosa observó 24 horas después de la inoculación. Tras superar con éxito el apoyo a la formación de biopelículas, la monocapa CFBE era irreparable y ahora está prácticamente ausente. Biofilm residual, creciendo como una capa plana de bacterias, se muestra correspondientes a la cubreobjetos. Barra de escala, 20 micras. <img src="/files/ftp_upload/2186/2186fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. P. biofilms aeruginosa crecido en la superficie apical de las células CFBE confluente con la estática Co-cultura Modelo Biofilm y la celda de flujo Co-cultura Modelo Biofilm. (A) Imagen de un Representante P. expresan GFP biofilm aeruginosa crecido en una monocapa de células CFBE utilizando la estática Co-cultura Modelo Biofilm, evaluada por microscopía de epifluorescencia. La imagen es una superposición de los canales de contraste de fase y el canal de fluorescencia. Barra de escala, de 35 micras. (B) La imagen de un P. GFP-etiquetados biofilm aeruginosa crecido durante 6 horas en una monocapa de células CFBE utilizando la celda de flujo Co-cultura Modelo Biofilm. Para facilitar la visualización de la monocapa de las vías respiratorias, los núcleos se tiñeron con 10 mg / ml Hoechst 33342 (Molecular Probes) durante 30 minutos antes de la inoculación con P. aeruginosa. Imágenes fusionadas y pseudocolored fueron vistos por contraste de interferencia diferencial (DIC), y las imágenes correspondientes que se muestran son fluorescentes. Biopelículas, se presentan como grupos verdes adheridos a la superficie apical de las células CFBE, se dispersan a través de las células de las vías respiratorias. Barra de escala, 20 micras. (C) la reconstrucción tridimensionalción de las pilas de la imagen de la serie Z que muestra el típico hongo estructuras de 6 h de edad, P. biofilms aeruginosa formando una monocapa de células CFBE. Barra de escala, 10 micras.

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Los biofilms son comunidades de bacterias que se forman en respuesta a estímulos ambientales. Estas señales ambientales que llevan a cambios en la regulación mundial dentro de cada bacteria, lo que resulta en la unión a una superficie, la agregación, la producción de exopolisacáridos y otros fenotipos como el aumento de la resistencia antibiótica 10. Durante el último par de décadas, la evidencia más ha apoyado la hipótesis de que los biofilms juegan un papel importante en la patogénesis de las i...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FCS2 (Focht Live-Cell) chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioptechs, Butler, PA</td>
<td>060319131616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FCS2 chamber controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioptechs, Butler, PA</td>
<td>060319-2-0303</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>40 mm glass coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioptechs, Butler, PA</td>
<td>PH 40-1313-0319</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Manassass, VA</td>
<td>#10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM without phenol red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Manassass, VA</td>
<td>Mediatech, Manassass, VA</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

co-culture models of pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells

Biopelículas bacterianas se han asociado con un número de diferentes enfermedades humanas, pero el desarrollo del biofilm en general ha sido estudiado en la no-vida superficies. En este trabajo se describe la formación de biofilms protocolos de Pseudomonas aeruginosa en las células de las vías respiratorias epiteliales humanas (células CFBE) en un cultivo. En el primer método (llamado estática Co-cultura Modelo Biofilm), P. aeruginosa se ​​incubaron con células CFBE cultivadas como monocapas confluentes en placas de cultivo tisular estándar. Aunque la bacteria es muy tóxica para las células epiteliales, la adición de arginina retrasos de la destrucción de la monocapa de tiempo suficiente para que las biopelículas que se forman en las células CFBE. El segundo método (llamado la celda de flujo Co-cultura Modelo Biofilm), consiste en la adaptación de un aparato de biofilm celda de flujo, que se utiliza a menudo en biofilm de investigación, para dar cabida a un cubreobjetos apoyando una monocapa de células CFBE. Esta monocapa se inocula con P. aeruginosa y una bomba peristáltica entonces fluye a través de un nuevo medio de las células. En ambos sistemas, las biopelículas bacterianas se forman dentro de las 6-8 horas después de la inoculación. Visualización de la película biológica se ve reforzada por el uso de P. aeruginosa cepas que expresan constitutivamente la proteína fluorescente verde (GFP). La estática y el flujo de cultivo de células Co-ensayos de biofilm son sistemas modelo para principios de P. Aeruginosa infección de la fibrosis quística (FQ) de pulmón, y estas técnicas permiten a los diferentes aspectos de P. la formación de biofilm aeruginosa y virulencia a estudiar, incluyendo la citotoxicidad biofilm, la medición de biofilm UFC, y las manchas y la visualización de la biopelícula.

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Este documento describe los diferentes métodos de cultivo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Biofilms en cultivos de células epiteliales de las vías humanos. Estos protocolos pueden ser adaptados para estudiar diferentes aspectos de la formación de biopelículas, incluyendo la visualización del biofilm, la tinción de la biopelícula, la medición de unidades formadoras de colonias (UFC) de la película biológica, y el estudio de citotoxicidad biofilm.

Los modelos de co-cultivo de Pseudomonas aeruginosa Biofilms Cultivado en las células vivas las vías respiratorias humanas

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

22.1K vistas.  Dartmouth College. Este documento describe los diferentes métodos de cultivo Pseudomonas aeruginosa Biofilms en cultivos de células epiteliales de las vías humanos. Estos protocolos pueden ser adaptados para estudiar diferentes aspectos de la formación de biopelículas, incluyendo la visualización del biofilm, la tinción de la biopelícula, la medición de unidades formadoras de colonias (UFC) de la película biológica, y el estudio de citotoxicidad biofilm.

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Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa y Biofilm Saccharomyces cerevisiae en las celdas de flujo

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Investigación

Inmunología e Infección

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

El aislamiento de ARN Pseudomonas aeruginosa Que colonizan el tracto gastrointestinal murino

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Crónica a largo plazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infección de las vías respiratorias en los ratones

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

La evaluación de la innata de detección de VIH-1 CD4 infectados<sup&gt; +</sup&gt; Células T por las células dendríticas plasmocitoides Usando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura del sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa inducida por la lesión pulmonar Modelo

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

Métodos para la detección de amiloides siguiente infección de pulmonar endotelial células citotóxicas por Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

Cultivo de la Pequeña Colonia Variante de Pseudomonas aeruginosa y Cantidad de su Alginato

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

Un modelo de inoculación tardía de la infección crónica por la herida de Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. aeruginosa Co-cultivo 3D infectado de células epiteliales bronquiales y macrófagos en la interfaz aire-líquido para la evaluación preclínica de los antiinfecciosos

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.