Este método puede ayudar a responder preguntas clave, sobre el desarrollo de biopelículas, como cómo identificar condiciones ambientales clave, que afectan el crecimiento de biopelículas y las características de comportamiento durante el desarrollo. La principal ventaja de esta técnica, es que las placas micro-fluidas multicanal, permiten la rápida adquisición de resultados estadísticamente significativos. Aunque este método puede proporcionar información sobre la estructura del biofilm, también se puede aplicar al estudio de tratamientos antibióticos y biorremediación.
Generalmente, los individuos nuevos en este método lucharán, porque se necesita una atención cuidadosa a los detalles del protocolo y las habilidades meticulosas. Para evitar un error de conexión del instrumento al software, encienda primero la estación de trabajo del PC, seguida del módulo de fluorescencia. Asegúrese de que el obturador de fluorescencia esté encendido y encienda los controladores de hardware.
A continuación, encienda el controlador del sistema de imágenes y la cámara CCD. A continuación, encienda la estación de imágenes. Cuando todo el equipo esté listo, inicie la aplicación de control e introduzca el número de placa, situado en la etiqueta en el lado de la placa.
Para el cebado, primero retire la placa micro-fluida de 48 pozos del embalaje, sin tocar la superficie de vidrio en la parte inferior de la placa, y limpie el portaobjetos de vidrio en la parte inferior de la placa, con un tejido de lente. Para preparar los canales micro-fluidos, pipetear 200 microlitros de 37 grados celsius mínimo medio en el pozo de salida, teniendo cuidado de evitar burbujas. A continuación, coloque la placa en la etapa de la placa.
Limpie la interfaz con etanol, sellándola en la etapa de la placa una vez que el etanol se haya secado. En el modo manual en el módulo de control, ajuste el fluido como caldo Luria-Bertani en 37 grados centígrados, y máximo como cinco dym por centímetro cuadrado. Haga clic en los pozos de salida para activar el flujo de la salida al pozo de entrada, para preparar los canales.
Después de cinco minutos, detenga el flujo para prepararse para la siembra y retire cuidadosamente la placa del escenario. A continuación, aspirar cualquier medio residual de la salida bien sin eliminar ningún medio del círculo interno que conduce a los canales micro-fluidos. Para sembrar los canales experimentales, añadir 300 microlitros de medio mínimo en el pozo de entrada, seguido de la adición de 300 microlitros de cultivo bacteriano, en el pozo de salida.
Vuelva a colocar la placa en la fase de imagen asegurándose de limpiar la interfaz con etanol antes de colocarla en la placa, y utilice la alimentación de la cámara en vivo para centrarse en un solo canal. Mientras monitorea visualmente la alimentación en vivo, reanude el flujo en 1 a 2 dym por centímetro cuadrado durante aproximadamente 2 a 4 segundos, Para permitir que las células entren en el canal experimental pero no en los canales de serpentina, y deje la placa en la etapa controlada por temperatura durante una hora, para permitir que las células se adhieran. Al final del período de fijación, retire cuidadosamente la placa de la etapa y aspire las bacterias de la salida bien sin alterar el canal.
A continuación, utilice una nueva punta de pipeta para quitar el medio de los pozos de entrada. En el software, abra la adquisición de múltiples dimensiones para controlar la adquisición de imágenes del microscopio y seleccione lapso de tiempo, varias posiciones de etapa y varias longitudes de onda. En la pestaña Guardar, cree un nombre base simple, asegurándose de que el nombre base de la bandeja si existe el archivo está activado.
Incluya los detalles esenciales del experimento en la descripción. Haga clic en Seleccionar directorio, para seleccionar la carpeta en la que se guardarán todos los archivos en la pestaña time lapse, ajuste la duración del tiempo experimental a 24 horas y establezca el intervalo de tiempo para adquirir imágenes cada cinco minutos a lo largo del experimento. Utilice la alimentación de la cámara en vivo y el objetivo 10x para establecer las posiciones del escenario, centrándose en el centro del canal, situado por encima o por debajo de los números de canal grabados en la placa.
Cambie al objetivo 20x y localice el área de visualización óptima y el plano focal dentro del canal. A continuación, agregue la posición de la etapa a la lista con la nueva configuración. Bajo el menú de longitudes de onda, establezca el número de longitudes de onda en 3, y establezca la primera longitud de onda en FITC 100%camera, con un tiempo de exposición de diez milisegundos, la segunda longitud de onda en brightfield 50%camera 50%visible, con un tiempo de exposición mínimo de 3 milisegundos y la tercera longitud de onda a todos cerrados, por lo que no queda luz en el último canal entre los tiempos de adquisición.
En el menú de edición de AutoRun, abra la pestaña de configuración del protocolo y establezca un nuevo protocolo con una duración de 24 horas con el flujo establecido en la dirección de avance a la velocidad de cizallamiento experimental adecuada. Haga clic en Agregar y guardar como para guardar el protocolo y abrir la pestaña de configuración de secuencia. Para configurar una nueva secuencia, seleccione caldo Luria-Bertani a 37 grados, como fluido predeterminado para todos los canales.
En la iteración de paso 1 para los canales 1 a 12, seleccione el protocolo con la primera velocidad de cizallamiento experimental y habilite todos los canales. Para los canales 13 a 24, seleccione el protocolo con la segunda velocidad de cizallamiento experimental y habilite todos los canales. A continuación, seleccione Aplicar y guardar como para guardar la secuencia y abra el menú Ejecución automática para seleccionar la secuencia guardada que se utilizará para la ejecución automática.
Para configurar el experimento de biopelícula de crecimiento cronometilado, agregue hasta 1300 microlitros de medio mínimo estéril en el pozo de entrada de la placa micro-fluida, y devuelva la placa a la etapa de imagen. A continuación, limpie la interfaz con etanol y selle la placa. Confirme que los protocolos y secuencias están configurados correctamente.
Seleccione inicio, para iniciar AutoRun, y haga clic inmediatamente en adquirir para iniciar la colección de imágenes del microscopio. Al final de la primera adquisición de imagen, haga clic en pausar y seleccione el modo de imagen en vivo en la longitud de onda de campo brillante. Seleccione ir a para ver cada posición de etapa y seleccione establecer en actual, para establecer los nuevos ajustes.
A continuación, haga clic en reanudar, antes de comenzar la siguiente adquisición programada. En este experimento representativo de crecimiento de biopelícula cronometrando, la cobertura de biopelículas, o el porcentaje de superficie de umbral, fue diferente para los tres ajustes de cizallamiento, lo que indica que la cizalladura tuvo una influencia directa en la cobertura de la superficie del biofilm. La medición relativa total de la acumulación de biopelícula, aumentó en función del tiempo, con la tasa de crecimiento disminuyendo de la tensión de cizallamiento más alta a la tensión de cizallamiento más baja.
En cada condición, también hubo un período claro de crecimiento exponencial a partir del cual se podía calcular una tasa de crecimiento cuantitativo. En general, el coeficiente de rugosidad disminuyó con el tiempo en todas las condiciones de cizallamiento, lo que indica que todas las superficies de biopelícula se volvieron más suaves. Sin embargo, en comparación con la cizalladura más baja, los ajustes de cizallamiento más altos resultaron en una superficie más suave con el tiempo, lo que indica que un flujo de cizallamiento más rápido contribuye a una superficie más suave y más uniforme.
Además, la entropía textural, o la aleatoriedad en la morfología, aumentó con el tiempo para todas las condiciones de cizallamiento. Al realizar este procedimiento es importante recordar seguir la secuencia especificada y tomarse el tiempo para realizar cada paso con precisión. Las habilidades necesarias pueden tomar algunas carreras para dominar.
Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como HBLC o GCMS, para responder preguntas adicionales sobre las concentraciones de sustratos, como la glucosa, que se consume. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las biopelículas exploraran entornos de flujo general en tiempo real con condiciones experimentales controladas y muestreo de hidroterapia. No olvide que trabajar con cepas bacterianas BSL2 puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de equipos de protección adecuados y el uso de protocolos de residuos adecuados durante la realización de este procedimiento.
