1. Montaje del sistema de celda de flujo con todos los componentes El sistema de flujo montado incluye: tubos de autoclave, trampas de burbujas, una botella de medio / residuos y células de flujo como se muestra en la Figura 1. Todas estas piezas se pueden reutilizar entre los experimentos. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La celda de flujo de configuración del sistema (componentes esenciales de la configuración). El sistema de celda de flujo consta de varios componentes: una botella de medio, una bomba peristáltica, trampas de burbujas, la celda de flujo, una botella de residuos, y diversas secciones de la tubería entre sí por conectores diferentes. Figura amablemente proporcionados por Runa Lyngklip. 2. Asamblea de la celda de flujo <ol><li> La celda de flujo (Figura 2a) se trata con carriles fina de pegamento de silicona, con una jeringa (Figura 3). </li><li> Coloque una hoja de cubierta en la parte superior de las líneas de silicona (Figura 3). Se desliza cubierta de vidrio se utilizan como sustrato para P. aeruginosa, mientras se desliza la cubierta de PVC se aplican para S. cerevisiae biofilm. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Esquema de la celda de flujo y la trampa de la burbuja 2. Descripción detallada de las dimensiones utilizadas para la producción de una trampa de la burbuja) flujo de células b), DTU Biología de Sistemas. Reproducido con permiso de John Wiley &amp; Sons, Inc., (DTU Biología de Sistemas tenía anteriormente derecho Biocentrum, como se muestra en la figura) <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Ilustración de las líneas de aplicación de silicona pegamento para la fijación del sustrato de vidrio. La cubierta de vidrio se indica se coloca sobre el pegamento de silicona para sujetarlo a la celda de flujo. <ol start="3"><li> A su vez la celda de flujo y colóquelo sobre una superficie plana con la cara cubierta antideslizante abajo. Presione suavemente en la parte posterior de la celda de flujo para empujar la hoja de la cubierta en la base de la celda de flujo. A su vez la celda de flujo e inspecciona las áreas que no están sellados por la silicona. El mango (pistón) de una jeringa se puede utilizar como una herramienta para presionar suavemente la celda de vidrio y confluyen. </li></ol> 3. Botella medio <ol><li> Colocar un tubo de silicona de alimentación (2 mm de diámetro interior) en una botella de medio e insertar un conector en línea recta en el otro extremo. </li><li> Se añade medio de la botella (para ver el contenido medio de &quot;los medios de comunicación&quot; del párrafo) Cubierta del conector y una botella con papel de aluminio y autoclave el medio. Asegúrese de que el extremo del tubo de suministro se fija por encima del nivel de líquido en la botella de medio o un efecto de sifón puede vaciar la botella medio al autoclave. </li></ol> 4. Conexión de la trampa de la burbuja, celda de flujo y bomba Montar toda la tubería de acuerdo con el esquema de la Figura 1. Use un tubo de silicona con excepción de la parte que va a través de la bomba peristáltica donde se aplica tubo Marprene. <ol><li> Con el fin de conectar el tubo de la botella medio a todas las cámaras de flujo individual, dividir un tubo en el número necesario de entradas aplicadas en el experimento. Use los conectores en T para que el número deseable de los tubos de conexión del tubo de alimentación a los tubos de Marprene en la bomba (ver Figura 1, T-conector). Es generalmente una buena idea para mantener el orden en la misma secuencia de los tubos y las celdas de flujo a través del sistema, para facilitar la identificación de los componentes en caso de fallas en el sistema. </li><li> Conecte cada tubo de alimentación individual (2 mm de diámetro) para Marprene tubos de la bomba con conectores rectos. Conecte el tubo de Marprene a una trampa de burbujas (figura 2b) a través de un tubo de silicona intermedio (1 mm de diámetro). Asegúrese de que la bomba está conectada a la entrada en la parte más alta de la trampa de la burbuja. </li><li> Conecte el tubo de salida resultante de las trampas de burbujas a la entrada de la celda de flujo (1 mm de diámetro), asegúrese de que la longitud de estos tubos permite a la célula de flujo que se mueve a la platina del microscopio confocal (normalmente 1 m). </li><li> Coloque jeringas de 5 ml en la parte superior de la trampa de la burbuja. Cierre las tapas con tapones adecuados. </li><li> En la salida de la celda de flujo conectar un corto, de aproximadamente 40 mm de piezas (1 mm de diámetro), la tubería y el uso de una &quot;reducción&quot; recto para conectar un tubo de drenaje (2 mm de diámetro) de la longitud necesaria. Coloque los tubos de desecho en el contenedor de residuos. </li><li> Es importante destacar que el contenedor de residuos se deben colocar siempre en el mismo nivel que las células de flujo, nunca por debajo del nivel de flujo de células. Además, asegúrese de que el final del tubo de drenaje se fija por encima del nivel esperado de desechos líquidos para evitar ras de espalda debido a un efecto de sifón cuando el manejo del flujo de las células. </li></ol> 5. ESTERILIZACIÓN Y LAVADO DEL SISTEMA DE FLUJO <ol><li> Quite las tapas de la burbuja trampas y colocarlas en el 70% de etanol para mantenerlos estériles. </li><li> Correr a mayor velocidad de la bomba para llenar el sistema con un 0,5% (v / v) de hipoclorito de sodio en el agua. &lt;/ Li&gt; <li> Colocar las tapas de la trampa de burbujas de nuevo cuando la burbuja de las trampas están completamente llenos. </li><li> Toque en el flujo de las células para eliminar las burbujas en la cámara de flujo. Tenga cuidado de no dañar la cubierta de vidrio frágil. </li><li> Deje que el sistema de esterilización de 3-4 h con un caudal de 3 ml / h / canal (tasa de 0,2 mm / s de flujo lineal). </li><li> Lave el sistema de 2.3 veces para vaciar todo el hipoclorito. Llenar y vaciar el sistema con agua estéril. Trampas de burbujas se debe vaciar por completo entre cada lavado. Esto se puede hacer mediante el bombeo en el aire hasta que las trampas de la burbuja han sido vaciados. Después de vaciar, quitar las tapas de las trampas de burbujas antes de rellenar el sistema. Vuelva a colocar las tapas después de la burbuja de las trampas han sido completamente llena de líquido. Repita según sea necesario. </li><li> Deje correr el agua estéril a través del sistema, con un caudal bajo (1-3 ml / h / canal) durante la noche o ir al siguiente paso. </li><li> Conecte la botella medio de la entrada y limpie el sistema con el medio de toda la noche a bajo caudal (3 ml / h / canal) a la temperatura donde se realizará el experimento llevado a cabo. Nota: trampas de burbujas se debe vaciar el agua antes de que el sistema se llena con el medio. </li></ol> 6. La inoculación de la celda de flujo <ol><li> De una cultura de la noche hacer una dilución a una densidad óptica deseada (por ejemplo, P. aeruginosa 0.001 OD 600 nm y 600 nm de diámetro exterior 0,1 S. cerevisiae). </li><li> Use una jeringa de 0,5 ml con una aguja 27G para cargar inóculo suficiente para llenar la cámara. 250 l es suficiente para que las cámaras de flujo con las dimensiones especificadas en este trabajo (Figura 2., 40 mm x 4 mm x 1 mm). </li><li> Detener la bomba peristáltica. </li><li> Abrazadera de la manguera de silicona que lleva a la celda de flujo para evitar el reflujo en el sistema. </li><li> Esterilizar el sitio de la inoculación en el tubo de silicona frotándolos con etanol al 70%. </li><li> Insertar la aguja en el tubo de silicona e introducir la punta en la entrada de la celda de flujo. Inyecte lentamente el inóculo en la cámara (con cuidado de no inyectar burbujas de aire). </li><li> Retire la aguja y limpie la zona de inyección con etanol al 70%, seguido de cerrado de inmediato el agujero con pegamento de silicona sobre el sitio de inyección. </li><li> Dé la vuelta a la celda de flujo y dejar que los microorganismos se adhieren al sustrato durante 1 hora sin flujo a través de la celda de flujo. </li><li> A su vez la celda de flujo, en marcha la bomba de mediano (3 ml / h / canal) y tomar la abrazadera del tubo de silicona. </li><li> El sistema se coloca para la incubación a 37 ° C en el caso de P. aeruginosa y 30 ° C en el caso de S. cerevisiae. </li><li> Biopelícula en las cámaras de flujo ahora puede ser visualizado por CLSM. </li></ol> 7. La tinción de BIOFILM de Microscopía <ol><li> Hacer una dilución de la coloración adecuada (por ejemplo, 1:1000 SYTO 9 viven mancha de S. cerevisiae) </li><li> Detener la bomba peristáltica. </li><li> Abrazadera del tubo de silicona que lleva a la celda de flujo. </li><li> Esterilizar sitio de la inoculación en el tubo de silicona frotándolos con etanol al 70%. </li><li> Use una jeringa de 0,5 ml con una aguja 27G para cargar la solución de tinción suficiente para llenar la cámara. 250 l es suficiente para que las cámaras de flujo se utilizan aquí. </li><li> Insertar la aguja en el tubo de silicona e introducir la punta en la entrada de la celda de flujo. Inyecte lentamente la solución de tinción en la cámara (tenga cuidado de no inyectar burbujas). </li><li> Retire la aguja y limpie la zona de inyección con etanol al 70%, seguido de cerrado de inmediato el lugar de inyección. </li><li> Salir de la celda de flujo sin flujo durante 15 minutos. </li><li> Retire la abrazadera e iniciar el flujo (3 ml / h / canal) </li><li> Adquisición de datos con el CLSM </li></ol>

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Hemos demostrado un sistema de celda de flujo que representa una poderosa herramienta en las investigaciones de biofilm. Combinado con imágenes en 3D mediante microscopía confocal, el sistema tiene una serie de ventajas en comparación con otros métodos de análisis de biopelículas microbianas mediante técnicas microscópicas más tradicionales. Este sistema permite la visualización en 3D de las comunidades microbianas que viven biofilm sin alteración de la comunidad. Microscopía de luz no se proporcione información detallada sobre los nichos de la biopelícula y al mismo tiempo proporciona una resolución de la microscopía electrónica a nanoescala de la biopelícula, que no permite imágenes de células vivas. Utilizando el sistema de flujo de canal descrito anteriormente hemos dilucidado la distribución espacial de las células bacterianas sensibles a varios antibióticos 5-8 (Figura 4a), la distribución de los compuestos extracelulares, por ejemplo, ADN y 11.9, la distribución de células móviles y no móviles de la misma especie dentro de una comunidad bacteriana 4,6,9 (Figura 4c). Tenemos la visión de que el sistema de celda de flujo se pueden utilizar para estudiar los aspectos de las biopelículas de levadura. Esta puede ser la distribución espacio temporal de biofilm de la levadura en respuesta a factores ambientales, tales como fungicidas, así como la identificación de genes implicados en el desarrollo de la levadura biofilm. A pesar de la levadura no se sabe a diferenciarse en células móviles y no móviles, otros aspectos de la diversificación de biofilm pueden ser los estudios tales como el cambio morfológico de la levadura a las células pseudohyphal y el cambio de haploides a las células diploides. Hemos mostrado un sistema que cumple con varias especies de microbios, y trabajará con varias técnicas de tinción. Una gran variedad de sondas de coloración diferente y las proteínas fluorescentes, tales como las buenas prácticas agrarias, facilitar la investigación específica de nicho en el biofilm en desarrollo y es una herramienta eficaz para analizar el efecto de los agentes antimicrobianos u otros factores ambientales. La información que se puede obtener es muy detallado (Figura 4) y las características del biofilm pueden ser cuantificados con los programas de ordenador como COMSTAT 12,13. En general, el aspecto más importante del protocolo es el hecho de que se trata de un proceso que consume tiempo. También es una limitación que las células deben ser capaces de crecer en un no-fluorescente, la superficie transparente. . Dado que la formación de biopelículas se analiza con un microscopio confocal, la profundidad que puede ser investigado se limita a unos pocos cientos de micrómetros 14 Hay más limitaciones técnicas inherentes en el diseño: el sistema no es adecuado para el cribado de alto rendimiento, como un investigador experimentado puede manejar más de 15 canales por experimento, que a su vez puede tomar varios días para prepararse. Sin embargo, los antibióticos o los mutantes que se consideran relevantes para los estudios de bio-película puede ser inicialmente masa tamizada con otros métodos como la tinción de cristal violeta antes de que los candidatos más interesantes son transferidos al sistema de celda de flujo. Las hojas de cristal de la cubierta son muy finas y se rompen con facilidad, y se debe tener cuidado al manipular los sistemas. Además los tubos deben ser examinados todos los días durante la ejecución de un experimento, como considerable &quot;back-crecimiento&quot; en los tubos de entrada justo antes de la células de flujo puede ocurrir. Tal contaminación puede ser resuelto mediante la eliminación de varios centímetros de tubo de silicona del lado de la entrada de las células de flujo, utilizando una técnica estéril. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4 a) cuatro días PAO1 de edad -. Biofilm las buenas prácticas agrarias tratadas durante 24 horas con colistina y yoduro de propidio para la tinción de muertos (mancha roja) b) presentación en 3D de un día de tres años de edad P. aeruginosa PAO1 (tipo salvaje P. aeruginosa) - GFP biofilm 6 c) presentación de imágenes 3D de una PAO1 - PPC pila mutante (azul) con un tipo de YFP PAO1 silvestres (amarillo) d) 5 días de edad PAO1 - GFP biofilm presenta como un 3D e imagen) 26 h S. cerevisiae (PTR3 mutante en CEN.PK fondo) biofilm teñidas con SYTO-9 15.

<ul><li> Trampas de burbujas, polietileno (DTU Biología de Sistemas, Universidad Técnica de Dinamarca, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument 20Center/Resources/Biofilm% 20Setup.aspx%) </li><li> Borrar los conectores de plástico de polipropileno y T-conectores (Cole Parmer, 1 / 8 pulgadas (3,175 mm) y 1 / 16 pulgadas (1.588 mm)) </li><li> Abrazaderas </li><li> Microscopio confocal (Zeiss, Meta LSM510) </li><li> Cubreobjetos de vidrio (Knittel Glaser) 50 x 24 mm </li><li> Cubreobjetos, PVC cubreobjetos (Rinzl) 50 x 24 mm </li><li> Celdas de flujo, de polietileno (DTU Biología de Sistemas, Universidad Técnica de Dinamarca, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument 20Center/Resources/Biofilm% 20Setup.aspx% </li><li> Botellas de medio (Schott) </li><li> Bomba peristáltica (Watson-Marlow, 205S) </li><li> Rolling carrito de sistemas de flujo y bombas </li><li> Pegamento de silicona (3M super sellador de silicona transparente) </li><li> Jeringa de 5 ml (Terumo) </li><li> SYTO 9 (Molecular Probes) </li><li> 0,5 ml jeringas con agujas (27G, Terumo LU-100) </li><li> Residuos de envases </li></ul> Tubería: <ul><li> De silicona, 3 mm de diámetro exterior, 1 mm de diámetro interior (Ole Dich) </li><li> De silicona, 4 mm de diámetro exterior y 2 mm de diámetro interior (Ole Dich) </li><li> Marprene, 3 mm de diámetro exterior, 1 mm de diámetro interior (Watson-Marlow) </li></ul> Medios de comunicación <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> P. aeruginosa medio </td></tr><tr><td> A10 </td><td> g / L </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 X 2 H 2 O </td><td> 6.0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> FB </td></tr><tr><td> MgCl2 6H 2 O </td><td> 0.20 </td></tr><tr><td> 1 ml 1 M de CaCl2 </td><td> 0.01 </td></tr><tr><td colspan="2"> 100 L / L trazas de metales (por P. aeruginosa biofilms) 4 </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td colspan="2"> Mezcla A10 y FB en una proporción de 1:10. </td></tr><tr><td colspan="2"> Añadir fuente de carbono a la concentración deseada. </td></tr></tbody></table> <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> S. cerevisiae sintético completo (SC) medio </td></tr><tr><td></td><td> g / L </td></tr><tr><td> Sulfato de adenina </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-triptófano </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-histidina-HCl </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-arginina-HCl </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L-metionina </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-tirosina </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L-leucina </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> L-isoleucina </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> L-lisina HCL </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L-fenilalanina </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> Ácido L-aspártico </td><td> 0.10 </td></tr><tr><td> L-glutámico </td><td> 0.10 </td></tr><tr><td> L-valina </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> L-treonina </td><td> 0.20 </td></tr><tr><td> L-serina </td><td> 0.40 </td></tr><tr><td> Levadura NitRogen base de w / o aminoácidos y de amonio (Bacto) </td><td> 1.6 </td></tr><tr><td> Sulfato de amonio </td><td> 5.0 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 6.0 </td></tr><tr><td> El ácido succínico </td><td> 10.0 </td></tr><tr><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td> Glucosa (autoclave por separado) </td><td> 0.20 </td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa and saccharomyces cerevisiae biofilm in flow cells

Muchas células microbianas tienen la capacidad de formar comunidades de microorganismos sésiles define como biofilms que han alterado las propiedades fisiológicas y patológicas en comparación con los microorganismos de vida libre. Biofilms en la naturaleza son a menudo difíciles de investigar y residen en condiciones de poca definida 1. El uso de un sustrato transparente, es posible que un sistema en el dispositivo de biofilms simple puede ser examinado en una forma no destructiva en tiempo real: aquí se demuestra el montaje y operación de un sistema de flujo modelo de celular, para los estudios in vitro en 3D de biopelículas microbianas generando una alta reproducibilidad bajo condiciones bien definidas 2,3. El sistema consta de una celda de flujo que sirve como cámara de crecimiento de la biopelícula. La celda de flujo se suministra con nutrientes y oxígeno a partir de un frasco de medio a través de una bomba peristáltica y medio gastado se recoge en un recipiente de residuos. Esta construcción del sistema de flujo permite un suministro continuo de nutrientes y la administración de antibióticos por ejemplo, con la mínima perturbación de las células cultivadas en la cámara de flujo. Por otra parte, las condiciones de flujo dentro de la celda de flujo permiten estudios de biofilm expuestos a esfuerzos cortantes. Una burbuja de captura confines dispositivo de burbujas de aire de la tubería que podrían alterar la estructura del biofilm en la celda de flujo. El sistema de celda de flujo es compatible con microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) y por lo tanto puede proporcionar información en 3D muy detallado sobre el desarrollo de biopelículas microbianas. Las células en el biofilm pueden ser etiquetados con sondas fluorescentes o proteínas compatible con el análisis de CLSM. Esto permite la visualización en línea y permite la investigación de nichos en el biofilm en desarrollo. Interrelación microbiana, la investigación de agentes antimicrobianos o la expresión de genes específicos, son muchas de las configuraciones experimentales que se pueden investigar en el sistema de celda de flujo.

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Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocolo que describe la aplicación de un sistema de celda de flujo para el cultivo y el análisis de biofilms microbianos para microscopía de escaneo láser confocal (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa y Biofilm Saccharomyces cerevisiae en las celdas de flujo

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

pseudomonas-aeruginosa-saccharomyces-cerevisiae-biofilm-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

36.5K vistas.  Danish Technical University. Protocolo que describe la aplicación de un sistema de celda de flujo para el cultivo y el análisis de biofilms microbianos para microscopía de escaneo láser confocal (CLSM).

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Los modelos de co-cultivo de Pseudomonas aeruginosa Biofilms Cultivado en las células vivas las vías respiratorias humanas

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Investigación

Inmunología e Infección

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

El aislamiento de ARN Pseudomonas aeruginosa Que colonizan el tracto gastrointestinal murino

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Crónica a largo plazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infección de las vías respiratorias en los ratones

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen which establishes chronic pulmonary infections in patients with cystic fibrosis (CF). The overproduction of a capsular polysaccharide called alginate, also known as mucoidy, promotes the formation of mucoid biofilms which are more resistant than planktonic cells to antibiotic chemotherapy and host defenses. Additionally, the conversion from the nonmucoid to mucoid phenotype is a clinical marker for the onset of chronic infection in CF. Alginate overproduction by P. aeruginosa is an endergonic process which heavily taxes cellular energy. Therefore, alginate production is highly regulated in P. aeruginosa. To better understand alginate regulation, we describe a protocol using the mini-himar1 transposon mutagenesis for the identification of novel alginate regulators in a prototypic strain PAO1. The procedure consists of two basic steps. First, we transferred the mini-himar1 transposon (pFAC) from host E. coli SM10/&#955;pir into recipient P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugation to create a high-density insertion mutant library, which were selected on Pseudomonas isolation agar plates supplemented with gentamycin. Secondly, we screened and isolated the mucoid colonies to map the insertion site through inverse PCR using DNA primers pointing outward from the gentamycin cassette and DNA sequencing. Using this protocol, we have identified two novel alginate regulators, mucE (PA4033) and kinB (PA5484), in strain PAO1 with a wild-type mucA encoding the anti-sigma factor MucA for the master alginate regulator AlgU (AlgT, &#963;22). This high-throughput mutagenesis protocol can be modified for the identification of other virulence-related genes causing change in colony morphology.

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Here we describe a protocol using the mini-himar1 mariner transposon-mediated mutagenesis for generating a high-density insertion mutant library to screen, isolate and identify novel alginate regulators in the prototypic Pseudomonas aeruginosa strain PAO1.

Identificación de nuevos genes asociados con alginato producción en<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Uso de Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; La mutagénesis mediada por transposón Mariner

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa inducida por la lesión pulmonar Modelo

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

Llegado al lado de la luz: Vivo en monitoreo de Pseudomonas aeruginosa Biofilm infecciones en las heridas crónicas en un diabético sin pelo modelo murino

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

Replicación de la ordena, no redundante biblioteca de Pseudomonas aeruginosa cepa PA14 mutantes de inserción de transposones

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

Métodos para la detección de amiloides siguiente infección de pulmonar endotelial células citotóxicas por Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

Generación de mutantes de eliminación de genes en el marco en Pseudomonas aeruginosa y pruebas para la atenuación de la virulencia en un modelo simple de infección de ratón

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...