Nuestro protocolo proporciona una forma de estudiar las bacterias resistentes a los antibióticos en un entorno nutricional y físico similar a cómo probablemente existan in vivo. Una de las mayores ventajas de esta técnica es la capacidad de capturar imágenes de alta resolución y datos fenotípicos de bacterias en tamaños de población relevantes para la infección. Eso es agregados de aproximadamente 10 a 1, 000 celdas.
Demostrando el procedimiento estará Alexa Gannon, una asistente de investigación graduada de mi laboratorio. Para comenzar, esterilice el medio que contiene mucina bajo luz ultravioleta durante cuatro horas. Transfiera la mucina tratada con UV a tubos estériles de 1,7 mililitros en condiciones estériles y almacene los tubos a menos 20 grados centígrados.
Después de preparar la base tamponada, agregue la solución de mucina en la base tamponada que contiene ADN como se describe en el manuscrito de texto. La noche anterior al experimento, inocular cinco mililitros de caldo LB con varias colonias de Pseudomonas aeruginosa PAO1 pMRP91 a partir de un antibiótico que contiene una placa de agar LB y cultivar la bacteria durante la noche a 37 grados centígrados con agitación a 250 revoluciones por minuto. A la mañana siguiente, al menos dos horas antes de comenzar el experimento, encienda el microscopio de barrido láser confocal y abra el módulo de incubación en el software de imágenes asociado.
Diluir 500 microlitros del cultivo en cinco mililitros de caldo LB fresco e incubar la suspensión bacteriana a 37 grados centígrados y 250 revoluciones por minuto durante 60 a 90 minutos. Cuando las bacterias hayan entrado en la fase de registro, peletizar las células bacterianas por centrifugación y lavar las células tres veces con pbs esterilizados por filtro. Después del último lavado, vuelva a gastar el pellet en un mililitro de PBS.
Mida la absorbancia de la suspensión celular bacteriana a 600 nanómetros para determinar el volumen de cultivo requerido para una densidad óptica de 0,05 en cinco mililitros de esputo sintético de fibrosis quística medio dos. Inocular el volumen calculado de suspensión celular bacteriana en el medio y el vórtice suavemente antes de agregar un mililitro de células a cada cámara de un plato de cultivo óptico de cuatro cámaras, luego incubar las bacterias durante cuatro horas en condiciones estáticas a 37 grados centígrados. Para obtener imágenes de los agregados de Pseudomonas aeruginosa mediante microscopio de barrido láser confocal, al final de la incubación, designe tres pomos de la placa de cultivo como réplicas del tratamiento antibiótico y uno bien como el control sin tratamiento y coloque la placa en la etapa calentada en el microscopio.
Seleccione un objetivo de inmersión de aceite 63X y abra la pestaña de localización para identificar los agregados bacterianos en el campo brillante. Defina un área para obtener imágenes dentro de cada pozo y use el módulo de posiciones para almacenar la posición del área. Establezca la longitud de onda de excitación en 488 nanómetros y la longitud de onda de emisión en 509 nanómetros.
En el módulo de adquisición, seleccione la opción Z-stack para adquirir las imágenes y utilice el módulo de promedio de línea para reducir la fluorescencia de fondo en el canal GFP dentro del volumen total de las imágenes Z-stack. Establezca la opción de serie temporal para capturar 60 rebanadas en cada pozo a intervalos de 15 minutos durante 18 horas y use la estrategia de enfoque definida para almacenar un plano focal para cada posición que se volverá a imaginar en cada punto de tiempo a lo largo del experimento. 4-1/2 horas después de configurar el experimento de imágenes, imagine cada posición para determinar la biomasa agregada dentro de cada uno de los cuatro pozos antes de la adición del antibiótico.
Después de seis horas, agregue suavemente el antibiótico dos veces por debajo de la concentración inhibitoria mínima al medio de cada pozo, simplemente sople la interfaz del líquido de aire y haga clic en iniciar el experimento para comenzar la imagen del tratamiento posterior al antibiótico. Para aislar las células vivas, al final del período de imágenes de 18 horas, etiquete las bacterias en cada pozo con el volumen apropiado de yoduro de propidio de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Al final de la incubación, use un recipiente aislado para transferir la placa al citómetro de flujo y configure el citómetro para detectar GFP y yoduro de propidio utilizando una boquilla de 70 micras, luego ejecute alícuotas de un mililitro de cada sobrenadante de cultivo a la tasa de flujo más baja para clasificar los agregados viables de Pseudomonas aeruginosa con yoduro de propidio positivos y no viables.
Para cuantificar la dinámica agregada, cargue las imágenes en un programa de software de análisis de imágenes apropiado y cree histogramas de los recuentos producidos para los cultivos de control no tratados y tratados con antibióticos en el canal GFP para permitir la cuantificación de la fluorescencia de fondo. Para garantizar que los vóxeles GFP detectados se correlacionen con la biomasa bacteriana, defina un vóxel GFP positivo como mayor o igual a 1,5 veces el valor del recuento de fondo GFP. Produzca las superficies ISO para todos los vóxeles restantes y para detectar agregados individuales, habilite la opción dividir objetos y defina los agregados como objetos.
Utilice el módulo vantage para calcular el volumen XYZ y la suma de los vóxeles GFP para cada objeto individual. Exporte estos datos a una plataforma estadística externa. Filtre los datos exportados por tamaño para definir objetos con volúmenes mayores o iguales a cinco micrómetros cúbicos.
Elimine cualquier objeto de menos de 0,5 micrómetros cúbicos y utilice el módulo de vista para calcular la distancia de cada objeto en relación con otros objetos dentro de cada imagen. Alternativamente, la distancia se puede calcular utilizando la fórmula, luego use la suma y los cálculos promedio para determinar la biomasa total en el volumen agregado promedio. Aunque quedan múltiples agregados bacterianos viables después de cuatro horas de aplicación de antibióticos, la biomasa total de las poblaciones agregadas dentro de los cultivos tratados con antibióticos se reduce significativamente en comparación con la de los cultivos no tratados.
La microscopía de series temporales se puede utilizar para determinar los patrones espaciales entre los agregados sensibles positivos para yoduro de propidio y los agregados tolerantes positivos para GFP después del tratamiento con antibióticos. Al calcular cómo los agregados de diferentes tamaños contribuyen a la población general, se pueden identificar patrones de cómo los agregados responden al tratamiento con antibióticos en relación con su tamaño, forma y posición. Después del tratamiento con antibióticos, los agregados viables y no viables se pueden separar con éxito de acuerdo con su expresión de señal fluorescente.
Esperamos que este protocolo inspire a otros investigadores a estudiar su organismo de elección a una resolución similar. Nuestro objetivo es encontrar hilos biológicos comunes en estas comunidades complejas, independientemente del sitio de infección.
