Notre travail a été rendu possible par le soutien financier de McKnight Fonds de dotation pour les neurosciences (PAS), le National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022; PAS) et un pré-doctorale NIH NRSA bourse pour PA (F31AA017042) de l&#39;Institut national sur les abus d&#39;alcool et l&#39;alcoolisme. Le mutant GIRK2-L257W a été fourni par le Dr Prafulla Aryal. Microscope à fluorescence et le parrainage aimablement fournies par les instruments Leica.

<ol>
	<li>Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discrete+alcohol+pocket+involved+in+GIRK+channel+activation.">A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation.</a> Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).</li><li>Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+similarities+between+glutamate+receptor+channels+and+K++channels+examined+by+scanning+mutagenesis.">Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis.</a> J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).</li><li>Doyle, D. A., Cabral, M. o. r. a. i. s., Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &amp;amp, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+potassium+channel:+molecular+basis+of+K++conduction+and+selectivity.">The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity.</a> Science. 280, 69-77 (1998).</li><li>Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+Kir3.1-prokaryotic+Kir+channel+chimera.">Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera.</a> EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).</li><li>Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+eukaryotic+strong+inward-rectifier+K++channel+Kir2.2+at+3.1+&amp;Aring;+resolution.">Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 &amp;Aring; resolution.</a> Science. 326, 1668-1674 (2009).</li></ol>

La mutagenèse dirigée est une approche classique pour étudier les relations structure-fonction des canaux ioniques. Il est basé sur la prémisse que, en changeant un résidu critique du canal ionique on devrait être capable d&#39;observer des changements prononcés dans la fonction de canal. En revanche, de nombreuses mutations non-critique de position peuvent être introduits sans perturbations majeures à la fonction de canal. Typiquement, le résidu en question est d&#39;abord muté en alanine, un petit non polaires des acides aminés, suivi par une mutation au tryptophane, la plus importante d&#39;acides aminés 2. Si le résidu est importante pour la fonction de canal, les deux mutations va changer l&#39;activité du canal. Si un résidu moins essentiel est muté, les effets de la mutation, en particulier à l&#39;alanine sont souvent anodins. Mutations tryptophane sont plus susceptibles de causer des changements à cause de problèmes stériques associés à la taille de tryptophane. Souvent, lorsque l&#39;information structurelle est manquant, la mutation systématique de l&#39;alanine ou de tryptophane dans un fragment de canal (appelé alanine ou tryptophane scan) peut être utilisé pour localiser les résidus critiques. Il est important de noter que les clones multiples avec différentes mutations ponctuelles peuvent être préparés en parallèle permettant de dépistage de résidus multiples dans des délais relativement courts. Récemment, plusieurs structures cristallines des canaux sont devenus disponibles 3,4,5. Ils peuvent être utilisés pour proposer potentiels résidus clés pour être testés en utilisant l&#39;approche décrite dans ce protocole. Les mesures sur le canal de type sauvage doit toujours accompagner la mesure d&#39;un canal de mutant pour servir de contrôle positif pour s&#39;assurer que les expériences de transfection et électrophysiologiques ont été effectués correctement. Des mutations ponctuelles peuvent conduire à un manque d&#39;un courant fonctionnelle, un projet similaire en cours à la régulation de type sauvage ou altéré de l&#39;activité du canal. Manque de courant mesurable peut être dû au trafic de pliage ou modifié incorrecte. Dans un tel cas il peut être utile pour savoir si le canal trafics correctement à la surface en utilisant un dosage biotinylation ou immunofluorescence contre le tag extracellulaire (sans perméabilisation cellulaire) faire la distinction entre non-fonctionnelles des canaux sur la membrane plasmique et des canaux de retenue à l&#39;intérieur de la cellule . Enfin, il est conseillé d&#39;étudier non seulement l&#39;activité basale du canal, mais aussi les conséquences de la mutation sur la régulation des canaux. Différents mécanismes de modulation de la fonction de canal pourrait être étudiée en fonction du canal ionique d&#39;intérêt, y compris la régulation par les protéines G, PIP2, des ions, la concentration en ATP, la phosphorylation (en utilisant la tyrosine, sérine thréonine ou mutation), l&#39;ubiquitination ou sumoylation (en utilisant la mutation lysine) et ouvreurs de canaux directs ou bloquants.

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 <div>
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 <thead>
 <tr>
 <td>Material Name</td>
 <td>Type</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comment</td>
 </tr>
 </thead>
 <tbody>
 
<tr>
<td>Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Varies</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Prep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>27104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Radiacwash</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biodex</td>
<td>005-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>CB40210</td>
<td>Poly-L-lysine can also be used</td>
</tr>
<tr>
<td>Maxi Prep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12263</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stratagene</td>
<td>200512-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover slips &#x02C6;&#x2026; 12 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>CS-12R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary Glass Tubing Borosilicate-standard wall</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>G150-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="_blank">Inverted fluorescence microscope</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>DMI3000 B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrophysiology</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon/ Leica/ Zeiss</td>
<td>Any inverted DIC (Hoffmann) microscope with fluorescence</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Axon Axopatch 200B amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Perfusion system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>VC-6 Perfusion MM-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digitizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Digidata 1320 digitizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manipulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Manipulator: MP-85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrode Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige</td>
<td>PC10 vertical electrode puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isolation Table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Manufacturing Corporation</td>
<td>Air table</td>
<td>&nbsp;</td> </tbody>
 </table>
 </div>

mutagenesis and functional analysis of ion channels heterologously expressed in mammalian cells

Nous allons démontrer comment étudier les effets fonctionnels de l&#39;introduction d&#39;une mutation ponctuelle dans un canal ionique. Nous étudions la protéine G-dépendants de potassium intérieurement rectifier (dénommé GIRK) canaux, qui sont importants pour la régulation de l&#39;excitabilité des neurones. Il ya quatre sous-unités différentes de mammifères canal GIRK (GIRK1-GIRK4) - nous nous concentrons sur GIRK2 parce qu&#39;il forme un homotétramère. La stimulation de différents types de G récepteurs couplés aux protéines (RCPG), tels que le récepteur muscarinique (M2R), conduit à l&#39;activation des canaux GIRK. L&#39;alcool a également active directement les chaînes GIRK. Nous allons montrer comment muter un acide aminé par changer spécifiquement un ou plusieurs nucléotides dans l&#39;ADNc pour le canal GIRK. Cette séquence mutée ADNc sera amplifié dans les bactéries, purifié, et la présence de la mutation ponctuelle sera confirmée par séquençage de l&#39;ADN. L&#39;ADNc pour les chaînes de GIRK muté et de type sauvage sera transfecté dans des cellules embryonnaires humaines de rein HEK293T cultivées in vitro. Enfin, la cellule entière de patch-clamp électrophysiologie seront utilisés pour étudier les courants macroscopiques de potassium par les canaux exprimé ectopiquement GIRK de type sauvage ou muté. Dans cette expérience, nous allons examiner l&#39;effet d&#39;une mutation dans le L257W GIRK2 canaux sur l&#39;activation M2R-dépendants et alcoolo-dépendants.

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Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Nous allons démontrer comment étudier l&#39;effet d&#39;une mutation ponctuelle unique sur la fonction d&#39;un canal ionique.

Mutagenèse et analyse fonctionnelle des canaux ioniques hétérologue exprimée dans les cellules de mammifères

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

mutagenesis-functional-analysis-ion-channels-heterologously-expressed

Research

JoVE Journal

Biology

17.3K vues.  Salk Institute for Biological Studies. Nous allons démontrer comment étudier l'effet d'une mutation ponctuelle unique sur la fonction d'un canal ionique.