Alkol Suistimali Ulusal Enstitüsü ve PA için bir ön doktora NIH NRSA dostluk (F31AA017042); Çalışmalarımız Neuroscience (PAS), Ulusal Uyuşturucu Enstitüsü (PAS R01 DA019022) McKnight Endowment Fund mali desteği ile mümkün yapıldı Alkolizm. GIRK2 L257W mutant Dr. Prafulla Aryal tarafından sağlanmıştır. Floresan mikroskop ve sponsorluk nazik Leica Instruments tarafından sağlanmaktadır.

1. Sitesi Mutagenez Yönetmen Biz GIRK2 memeli ifade plazmid pcDNA3.1 kodlama cDNA ve Stratagene (Agilent Technologies) Quikchange XL II site directed mutagenesis kiti kullanılarak, üreticinin talimatlarına göre bir nokta mutasyonu tanıtmak. Astarlar dizisi mevcut online astar tasarım programı kullanarak kolayca oluşturulabilir: <a href="https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15">https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15</a> Not: BD 14 ml tüpler protokol açıklanan yerine standart Eppendorf 1,5 mL tüpler kullanın. Ancak, XL10-Altın ultracompetent E. β-mercaptoethanol ile ön tedavi coli, 30s ısı şok ve NZY + (veya NZYM +) medya başarılı mutagenez için kritik öneme sahiptir. Mümkünse, yeni bir kısıtlama sitesi oluşturur ek bir sessiz mutasyon mühendislik Aşağıdaki mutant koloniler tarama için kullanışlı olabilir. 2. Miniprep, DNA Dizi ve Maxiprep 2.1 Qiagen miniprep ve sıralama. Bireysel bakteri kolonilerinin aldı ve ampisilin (AMP) ile LB suyu yetiştirilmektedir. Biz cDNA arındırıcı için üreticinin yönergelerini izleyin. Yukarıda Adım 1 dahil bir kısıtlama sitesi ise basit bir kısıtlama, sindirme, mutasyon, başarılı bir tanıtım teyit kullanılabilir. Otomatik DNA dizi analizi yapılır, off-site ve cDNA mutasyon varlığını doğrulamak için önemlidir, hem de herhangi bir istenmeyen mutasyonların olup olmadığını değerlendirmek. Bu adım çok önemlidir. Biz ileri T7 organizatörü ve BGH sıralama primerler ters kullanarak tüm GIRK kodlama dizisi dizisi pcDNA3.1 plazmid kanadında çoklu klonlama yeri. Not: sıralama Elektroferogram sıralama verileri yeterli kaliteyi sağlamak için dikkatli bir şekilde incelemek için önemlidir. Yüksek kaliteli Elektroferogram biraz arka plan gürültüsü ile keskin, örtüşmeyen zirveleri vardır. 2.2 Qiagen maxiprep. Biz üreticinin yönergeleri izleyin. Not: Bu adım verimli transfeksiyon için önemli olan cDNA saflık, geliştirmek için deneyler yer almaktadır. 3. HEK293T Hücre Kültürü ve Transfeksiyon Bütün bu adımlar, steril doku kültürü kaputu yapılmalıdır. 3.1 Hücre kültürü HEK293T hücreleri (37 ° C,% 5 CO 2 nemlendirilmiş inkübatör) kültüre kolay olduğu için, kullanımı kolay ve hızlı çoğaltma zaman, yüksek transfeksiyon verimliliği tüm hücre yama klemp elektrofizyoloji için uygun . HEK293T hücreleri plazmid pcDNA3.1 episomal çoğaltma sağlar SV40 büyük T antijeni ifade eder. HEK293T hücreleri L-glutamin ile desteklenmiş düşük glukoz DMEM medya ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) kültür. Pasajlanması hücreleri, hücreler / FBS içeren taze medya ilavesi ile enzim aktivitesi durur, doku çanak ayırmak kadar bekleyin, tripsin / EDTA konfluent (% 90-95) HEK293T hücrelerin% 0.25 ekleyin. Plaka ~ 1 X 10 5 hücre / 1 ml de ortalama antibiyotik içermeyen kültür ortamı ile birlikte 12 kuyu hücre kültürü çanak içine. (1 X 10 5 hücre, yaklaşık 10 ml medya ile yeniden süspanse konfluent T25 balon elde edilen hücre süspansiyonu 350 mcL) . 3.2 Transfeksiyon 8-24 saat sonra, HEK hücreleri plastik yapışır ve transfeksiyon için hazır olacak. CDNA 0.2 mikrogram kanal, Invitrogen Lipofectamine 2000 kullanılarak cDNA 0.4 mikrogram M2R reseptör cDNA ve 0.04 mg YFP Transfect hücreleri. Not: Biz, başarılı bir şekilde (yeşil hücreler muhtemelen GIRK kanalları ve M2 reseptörleri içerecektir) transfekte hangi hücrelerin belirlemek için cDNA YFP küçük bir miktar kullanın. Kullanımı cDNA konsantrasyonu her klon için ayarlanması gerekir. 3.3 transfekte hücrelerinin Floresan görselleştirme. Yeri 12-iyi bir ters floresan mikroskop sahnede plaka ve YFP ifade hücrelerini inceleyen. DIC görüntü karşılaştırın ve yeşil hücreleri yaklaşık numarasını not edin. Bu transfeksiyon verimliliği bir tahmin sağlar. 24-iyi yemekleri ve Poly-D-lizin kaplı kapak fişleri 3.4 Hazırlık 12 mm cam kapak fişleri (Warner, CS-12R), deiyonize su ile yıkama ve bir gecede% 95 etanol sallayarak, Radiacwash bir gecede onları sallayarak temizleyin. Kullanana kadar% 70 etanol temiz kapak fişleri saklayın. Etanol ile Petri kabı, forseps ve brülör kullanarak etanol kapalı alev, bir koyun kapak fişlerid steril bir 24 plaka bir yer. Poli-D-lisin 250 mcL (PDL) çözümü ile her bir kuyunun kapağı [0.2 mg / ml] ve kapak fişleri gecede PDL çözüm dalmış steril kaputun altında oturup sağlar. Buharlaşmasını önlemek için Parafilm 24 plaka sarın. Ertesi sabah, PDL aspirat ve 2x steril su ile yıkayın. Tabak kapağı, kaputun altında kuruması için açık bırakın. Steril alüminyum folyo ile kaplı kapak fişleri ile 24 iyi yemekleri sarılmış ve hafta boyunca oda sıcaklığında saklanabilir. Kapağında 3.5 Kaplama transfekte HEK293T hücreleri fişleri 24 saat 24-iyi çanak (~ 4 X 10 3 hücre / kuyu) transfeksiyon, split hücreler cam kapak içeren sonra poli-D-lizin ile kaplı kayar. Not: transfekte hücreleri 24-72 saat yazılan transfeksiyon kadar kullanılabilir. Hücreler yama kelepçe elektrofizyoloji deney için ayrı ayrı kapak fişleri sağlamak için ayrılmıştır. 4. Elektrofizyoloji 4.1 hazırlanması Çözümler Ekstrasellüler (banyo) solüsyonu: 20 mM KCl, 140 mM NaCl, 0.5 mM CaCl 2, MgCl 2 2 mM ve 10 mM HEPES (NaOH ile pH 7.4 set). Kısım 20K banyo çözümü ve uygun modülatörleri <ul><li> 20K + Ba 2 + 1 mM BaCl 2 içeren çözüm: dahilde giderilmesi akımların spesifik bir inhibitörüdür </li><li> 20K + Karbakol&#39;ün: 5 mcM Karbakol&#39;ün ile çözüm: Belirli bir M2R agonist, G-proteinler M2R çiftler açık GIRK kanalları </li><li> 20K + Etanol: doğrudan GIRK kanalları etkinleştirmek için 100 mM EtOH içeren banyo solüsyonu </li></ul> Yeri banyo çözümleri hızlı değişim perfüzyon sistemi şırınga (solüsyon kaplarında). Not: Biz bir Warner tutam valf sistemi, banyo çözümleri kontrol etmek için kullanır. PE boru tavsiye edilir. İç / elektrot çözüm: 140 mM KCl, 20 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5.4 mM MgCl 2, 2.5 mM K 2 ATP ve 0,3 mcM Li 2 GTP ile 10 mM HEPES (pH, 7.4 &#39;). ATP ve GTP olmadan elektrot çözümü olun. Biz, -80 ° C&#39;de saklanan ATP ve GTP hacimde ayrı ayrı hazırlamak ve deney günü elektrot çözüm ekleyin. ATP / GTP korumak için buz üzerinde son elektrot çözümü ile şırınga tutar. Biz steril filtre (0.2 mikron) iç / dış çözümler mikrobiyal gelişmeyi engellemek ve tüplerin tıkanma olasılığı ve elektrot azaltmak. 4.2 Çekme elektrotlar Biz Narishige iki adımlı dikey Warner Aracı (1.5 mm dış çapı, 0.86 mm iç çap ve 7.5 cm uzunluğunda) çektirmesi ve borosilikat cam elektrot intrasellüler çözümü ile dolu direnç M 3-7 elektrotlar elde etmek için kullanırlar. Not: Bu deneysel elektrot çektirmesi ve elektrot cam türü için laboratuarda parametrelerini belirlemek için gereklidir. Bizim dikey çektirmesi için, ikinci çekme için ilk çekin ve ~ 43 için 60.2, bir ısı ayarı kullanın. Sıkma 4.3 Tüm hücre yama <ol><li> Ters bir floresan mikroskop aşamasında dış çözüm yeri ve çanak kapağı, vazelin küçük miktarda kullanarak, bir 35 mm çanak kayma kapak monte edin. Odak ve hücreleri bulmak için DIC kullanın YFP pozitif hücreleri bulmak için floresan YFP geçmek. </li><li> Perfüzyon manifoldu yeşil bir hücre (hücre dışında ilgi = 2-3 hücre boyu 20-30 mikron) yakın pozisyon ucu. </li><li> Kazanç 1, Yapılandırma:: tam hücreli β = 1, mod V-klemp elektrotlar solüsyonu ile doldurun, aşağıdaki başlangıç ​​ayarları Axopatch 200B amplifikatör (headstage Axon Instruments) ekleyin. </li><li> Pipet tıkanmasını önlemek ve hücrenin hemen üzerinde elektrot ucu yere manipülatör kullanmak için elektrot pozitif basınç uygulayın. </li><li> Pipet potansiyeli Sıfır için bir test gerilimi adım sunmak için Seal Sına düğmesini seçin. 5 mV dikdörtgen gerilim adım Clampex Mührü Test penceresinde görünecektir. 0 nA akım baz-line getirmek için amplifikatör Pipet Ofset potansiyometre ayarlayın. Alternatif olarak, V-track modu ve &quot;0.00&quot; amplifikatör metre ekranda gerilim getirmek için amplifikatör Pipet Ofset potansiyometre VTrack ve kullanımı metre topuzu seçici amplifikatör moduna geçiş yaparak pipet potansiyeli sıfır. </li><li> Clampex 8.2 yazılımı (M 3-7 olmalıdır) sızdırmazlık test komutunu kullanarak elektrot direncini kontrol ediniz.. </li><li> Kayıtlı bir protokol dosyasını açın veya yeni bir protokol oluşturmak. Protokol dosya açmak için ana menüden seçin, ardından Aç Protokolü Edinme ve kayıtlı bir gerilim protokol dosyayı seçin. Bu deneme için, protokol 2 üzerinden 40 mV ile -100 mV ve rampa tek bir 50 ms gerilim adım teslim membran potansiyeli-40mV tutmak için yaratılmıştır00 ms. Bu protokol, her 2 saniyede yürütülür. GIRK kanalları ters potansiyel ve içe doğru bir düzeltme gözlem için rampa protokolü sağlar. Gerilim-kapılı iyon kanalları için, dikdörtgen planlı bir gerilim adım daha uygun olabilir. </li><li> Yaklaşım hücre kullanarak ince ayar manipülatör, pozitif basınç serbest, negatif basınç uygulamak hücre yüzeyinde dokunduktan sonra, ve direnç artışı izlemek Seal Test osiloskop penceresinde. Bir kez direnç GΩ aralığında, elektrot membranı (Gigaseal kurdu) üzerine imzalanmıştı. </li><li> Negatif basınç, hücre zarı kırmak ve hücre içine erişim almak için bir darbe uygulayın. Bir kez tam hücreli yapılandırma, kayıt kapasitif akımlar artmıştır. </li><li> Clampex Membran Test Switch ve erişim direnci Ra, membran direnci Rm, membran kapasitans Cm yazmak ve göz gerçek kapasitif akım teorik eğri üstel uyum doğrulamak. Membran kapasitans hücre boyutu ile doğru orantılıdır ve akım yoğunluğunun hesaplanması için daha sonra kullanılabilir olacak. </li><li> 10 kHz -40 mV ve filtre V-Out (membran potansiyeli) Testi, Seal geri dönün </li><li> Amplifikatör membran kapasitans ve seri direnç için aşağıdaki adımları ile telafi: <ol class="lalpha"><li> TÜM HÜCRE CAP switch. Düz bir test darbe elde edene kadar, ileri ve geri TÜM HÜCRE OTP ve SERİSİ DİRENCİ çevirir ayarlayın. Ayrıca pipet kapasitans FAST CAP topuzu ayarlamanız gerekebilir. </li><li> Yaklaşık% 60-80% TAHMİN düğmeyi çevirin, tekrar tekrar ayarlayarak TÜM HÜCRE OTP ve seri direnç arama (pipet kapasitans telafisi FAST CAP topuzu de ayarlamanız gerekebilir). </li><li> Yeniden ayarlayarak TÜM HÜCRE CAP ve seri direnç (pipet kapasitans telafisi FAST CAP topuzu de ayarlamanız gerekebilir) nabız düz tutmaya çalışırken, hücre salınan% COMP-% 100 çevirin. Zaman sabiti azaltarak gecikme ayarlayın. </li><li> Cm (membran kapasitans), Rs (seri direnç),% COMP değerleri bir yere yazın,% beklenenin ve Gecikme süresi notebook amplifikatör. Cm ve Rs yukarıdaki Membran Test ölçülen Cm ve Rm yaklaşık olarak aynı olmalıdır. </li></ol></li><li> Banyo çözümü kontrol etmek için harici bir çözüm valfi açın. 2kHz amplifikatör 8-kutuplu Bessel filtre ayarlayın, bir gerilim kelepçe protokolü açın ve kayıt akımları başlar. </li><li> Biz, 100 mV ile +40 mV üzerinde 200 ms 50 ms sonra rampalar -100 mV adımları ve her 2 saniyede teslim edilir bir rampa protokolü kullanarak GIRK akımları kaydedin. Rampa protokol ters potansiyel gözlem ve GIRK kanalları içe düzeltme özelliği sağlar. Oda sıcaklığında (22-25 ° C), akım GIRK yakın K (E K = -50 mV) için hesaplanan denge potansiyeline yakın -50 mV (banyosunda 20 mM KCl ile), ters gerektiğini, sonra devam E K olumlu potansiyelleri oldukça düz. </li><li> Deneysel Protokol: istikrarlı bir temel kaydettikten sonra, 20K + Karbakol&#39;ün çözüm geçmek ve 20K banyo çözümü için geri dönmek, tepki doruk beklemek, daha sonra 20K + Etanol uygulamak ve pik cevabı bekleyin, sonra 20K banyo çözüm geçmek ve nihayet 20K + Ba 2 + çözümü. Bu ilaçların uygulama esnasında GIRK akımları (en çok -100 mV telaffuz) genlik değişiklikleri görürsünüz. Notebook, farklı ekstrasellüler çözümler uygulamaya karşılık gelen iz numarasını not edin. Tek bir Clampfit dosyası tüm deney için tüm Piyango içerecektir. </li></ol> 5. Veri Analizi -100 MV veri GIRK akımları analiz etmek Clampfit 9.2 yazılımı kullanın. <ol><li> Kayıt ile dosyayı açın -100 mV imleç ayarlayın. Varsayılan olarak ekranda üst üste tüm izlerini göreceksiniz. &quot;Imleçler yaz&quot; simgesine basarak sayısal verilerini içeren Excel gibi bir elektronik tablo yaratacaktır. </li><li> Atama X tarafından takip numarası sütun ve imleci sütunun Y için ve hızlı bir deney bir zaman ders arsa çizebilirsiniz &quot;Grafik Oluştur&quot; ikonuna basarak. </li><li> Ba 2 + tek başına dış perfüzyon çözümü (&quot;20K mevcut&quot; eksi &quot;20K + Ba 2 + Akım&quot;) kaydedilen geçerli varlığı mevcut çıkarılarak bazal akımı hesaplayın. Aktive akımları 20K bazal akım çıkarılarak indüklenmiş akımlar hesaplayın (20K + Karbakol&#39;ün mevcut &quot;eksi&quot; 20K mevcut &quot;;&quot; 20K + Etanol geçerli &quot;eksi&quot; mevcut 20K &quot;). Membran kapasitans (amplifikatör doğrudan okuma) tarafından mevcut bölerek akım yoğunluğu (pA / pF) hesaplayın. Bazal akımlar tarafından indüklenmiş akımlar bölünmesi ve 100 ile çarpılması ile yüzde aktivasyon hesaplayın. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Yabani tip kanallar ile transfekte hücreler geçerli kayıt gerekir. GIRK kanal ölçmek içind ekstraselüler çözüm içeren 20 mM K + (145 mM K + hücre içi) güçlü içe düzeltme ve potasyum kanallarının önemli bir özelliği ~ -50 mV, ters bir potansiyel göstermelidir. Yabani tip akım karbakol uygulama (bazal aşırı akım 3-5 kat artış) üzerine güçlü bir artış ve 100 mM etanol aynı şekilde cevap verecektir. Not: elektrofizyoloji işareti kongre içe akım negatif ve dışa akımı pozitif. GIRK2 alkol bağlayıcı cebinde L257W mutasyon için, hem karbakol ve etanol zayıflatılmış tepkiler göreceksiniz. Bu L257 alkol ve G-protein aktivasyonu GIRK2 kanalları dahil olduğunu göstermektedir. GIRK2 mutagenez sonuçlarını daha fazla örnek için, Aryal ve arkadaşları tarafından son 1 yayınımıza bakın. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Yabani tip GIRK2 kayıt için Clampfit 8.0 gösterir veri dosyası Pencere Üst sol panelinde üst üste farklı bah harici çözümler varlığı bir rampa gerilimi protokole tepki olarak kaydedilen süpürür gösterir. İmleç 1 -100 mV konumlandırılmış. Imleç değerleri tablo (sağ panel) yazılır. Alt sol panelinde süpürme sayısına karşılık, mevcut arsa gösterir. Etanol (EtOH) ve karbakol (Carb) ve Ba 2 + ile inhibisyonu ile akım artışı (Çökmelerin) unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Mutant GIRK2 L257W kayıt Clampfit 8.0 gösterir veri dosyası Pencere Açıklamaları Şekil 1&#39;de olduğu gibi aynıdır. Karbakol (Carb) aktivasyon ve mutant kanalları EtOH indüklenen akımların azaltılması kaybı unutmayın.

<ol>
	<li>Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discrete+alcohol+pocket+involved+in+GIRK+channel+activation.">A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation.</a> Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).</li><li>Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+similarities+between+glutamate+receptor+channels+and+K++channels+examined+by+scanning+mutagenesis.">Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis.</a> J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).</li><li>Doyle, D. A., Cabral, M. o. r. a. i. s., Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &amp;amp, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+potassium+channel:+molecular+basis+of+K++conduction+and+selectivity.">The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity.</a> Science. 280, 69-77 (1998).</li><li>Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+Kir3.1-prokaryotic+Kir+channel+chimera.">Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera.</a> EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).</li><li>Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+eukaryotic+strong+inward-rectifier+K++channel+Kir2.2+at+3.1+&amp;Aring;+resolution.">Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 &amp;Aring; resolution.</a> Science. 326, 1668-1674 (2009).</li></ol>

Site-directed mutagenesis iyon kanallarının yapı-işlev ilişkileri incelemek için klasik bir yaklaşım. Bu, kritik bir kalıntı iyon kanalı değiştirerek bir kanal fonksiyonu belirgin değişiklikleri gözlemek gerekir önerme üzerine dayanır. Buna karşın, pek çok kritik olmayan pozisyonda mutasyonların kanal işlevi büyük tedirginlikler olmadan sokulabilir. Tipik olarak, söz konusu kalıntı ilk alanin, triptofan, 2 amino asitlerin en büyük mutasyon küçük bir polar olmayan amino asit, mutasyona uğramış. Kanal fonksiyonu için önemli bir kalıntı ise, her iki mutasyonların kanal aktivitesini değişecektir. Daha az temel kalıntısı mutasyona uğramış ise, mutasyon, özellikle alanin etkileri genellikle normaldir. Triptofan mutasyonlar triptofan boyutu ile ilişkili sterik engeller nedeniyle değişikliklere neden daha olasıdır. Genellikle, alanin veya triptofan yapısal bilgi kanalı (alanin veya triptofan tarama olarak adlandırılır) bir parçası, içinde eksik olan, sistematik mutasyon kritik artıkları bulmak için kullanılabilir. Paralel olarak, nispeten kısa bir süre içinde birden fazla artıkları test için izin ile birden fazla farklı nokta mutasyonlarının klonlar hazırlanmış olabilir dikkat etmek önemlidir. Son zamanlarda, kanal birden fazla kristal yapıları 3,4,5 kullanılabilir hale gelmiştir. Onlar bu protokolü açıklanan yaklaşım kullanarak test edilecek potansiyel kilit artıkları önermek için kullanılabilir. Yabani tip kanal ölçümleri her zaman doğru transfeksiyon ve elektrofizyolojik deneyleri yapıldı sağlamak için bir pozitif kontrol olarak hizmet mutant kanal ölçümü eşlik etmelidir. Nokta mutasyonlarının fonksiyonel bir akımı eksikliği, güncel bir kanal aktivite yabani tip ya da değiştirilmiş düzenlemeye benzer yol açabilir. Ölçülebilir mevcut olmaması, yanlış katlanır veya değişmiş kaçakçılığı nedeniyle olabilir. Böyle bir durumda kanal biyotinilasyon tahlil veya plazma zarı ve hücre içinde kalan kanallar fonksiyonel olmayan kanallar arasında ayırt etmek için ekstrasellüler etiketi karşı immünofloresan boyama (hücre permeabilization olmadan) kullanarak yüzeye doğru trafikleri olmadığını öğrenmek için faydalı olabilir . Sonuç olarak, kanal değil, aynı zamanda kanal düzenleme mutasyon sonucu bazal aktivite sadece araştırmak için tavsiye edilir. G proteinleri, PIP2, iyonlar, ATP konsantrasyonu, fosforilasyon (tirozin, serin veya treonin mutasyon kullanarak), ubikuitinasyon veya sumoilasyon (lisin mutasyon kullanarak) tarafından düzenlenmesi de dahil olmak üzere ilgi iyon kanal kanal fonksiyonu modülasyon farklı mekanizmalar göre ele olabilir , doğrudan kanal açıcılar veya blokerleri.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en"> 
 
 <div>
 <table border="1">
 <thead>
 <tr>
 <td>Material Name</td>
 <td>Type</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comment</td>
 </tr>
 </thead>
 <tbody>
 
<tr>
<td>Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Varies</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Prep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>27104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Radiacwash</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biodex</td>
<td>005-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>CB40210</td>
<td>Poly-L-lysine can also be used</td>
</tr>
<tr>
<td>Maxi Prep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12263</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stratagene</td>
<td>200512-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover slips &#x02C6;&#x2026; 12 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>CS-12R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary Glass Tubing Borosilicate-standard wall</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>G150-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="_blank">Inverted fluorescence microscope</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>DMI3000 B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrophysiology</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon/ Leica/ Zeiss</td>
<td>Any inverted DIC (Hoffmann) microscope with fluorescence</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Axon Axopatch 200B amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Perfusion system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>VC-6 Perfusion MM-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digitizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Digidata 1320 digitizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manipulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Manipulator: MP-85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrode Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige</td>
<td>PC10 vertical electrode puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isolation Table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Manufacturing Corporation</td>
<td>Air table</td>
<td>&nbsp;</td> </tbody>
 </table>
 </div>

mutagenesis and functional analysis of ion channels heterologously expressed in mammalian cells

Biz nasıl bir iyon kanalı bir nokta mutasyonu tanıtan fonksiyonel etkilerini incelemek amacıyla gösterecektir. Biz nöronların eksitabilite düzenleyen için önemli olan G-protein-kapılı içsel giderilmesi potasyum (GIRK olarak anılacaktır) kanalları, çalışma. Dört farklı memeli GIRK kanal alt birimden (GIRK1-GIRK4) vardır - bir homotetramer oluşturması nedeniyle biz GIRK2 odaklanır. Muskarinik reseptör (M2R) olarak G-protein reseptörler (GPCRs), farklı türde uyarılması GIRK kanal aktivasyonuna yol açar. Alkol aynı zamanda doğrudan GIRK kanallarını harekete geçirir. Biz özellikle cDNA GIRK kanal için bir veya daha fazla nükleotidler değişen bir amino asit nasıl mutasyona gösterecektir. Bu mutasyona uğramış cDNA dizisi saflaştırılmış bakteriler amplifiye olacak ve nokta mutasyonu varlığı DNA dizi tarafından teyit edilecektir. Mutasyona uğramış ve yabani tip GIRK kanallar için cDNAs in vitro kültür insan embriyonik böbrek HEK293T hücrelerine transfekte olacaktır. Son olarak, tüm hücre yama klemp elektrofizyoloji ektopik ifade yabani tip ya da mutasyona uğramış GIRK kanallar yoluyla makroskopik potasyum akımlarını incelemek için kullanılır. Bu deneyde, biz M2R bağımlı ve alkol bağımlısı aktivasyon GIRK2 kanal L257W mutasyon etkisi inceleyeceğiz.

Watch this Scientific Journal Video about Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells at JoVE.com

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Biz nasıl bir iyon kanalı fonksiyonu tek bir nokta mutasyonu etkisinin araştırılması gösterecektir.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

mutagenesis-functional-analysis-ion-channels-heterologously-expressed

Research

JoVE Journal

Biology

17.4K Görüntüleme.  Salk Institute for Biological Studies. Biz nasıl bir iyon kanalı fonksiyonu tek bir nokta mutasyonu etkisinin araştırılması gösterecektir.

Video: Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Biyoloji

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Memeli Hücrelerinde Glikoproteinler N-bağlı Şeker Zincirler Pulse-kovalamaca Analizi

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Memeli Hücrelerde DNA çift iplikli Break (DSB) Tamir Analizi

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Na fonksiyonel karakterizasyonu<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Seçim Proton-öldürme Kullanma hücre içi Bölmeler ve Eşanjörleri Plazma Membran Them Express