Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de la subvención número R21-HL094828-01 otorgado al Dr. Poelzing.

1. Prepare la función del ruido y la señal de entrada <ol><li> Crear una función de ruido que contiene los componentes de la frecuencia deseada. Esto se puede hacer mediante la descripción de los componentes de frecuencia deseada en el dominio de la frecuencia y el cálculo de la inversa de la transformada rápida de Fourier. En este estudio, 1 - 15 kHz se utiliza. Todas las transformadas de Fourier y la transformada de Fourier inversa se describe en este estudio se calcularon utilizando FFT de Matlab y funciones IFFT. </li><li> Escala de la amplitud de la función de ruido adecuado. En este estudio la función de ruido se redujo de tal manera que el cero a la máxima amplitud de la función de ruido es de 50 o 100 mV. </li><li> Crear un archivo de estímulo con los métodos apropiados para la adquisición de software que se utiliza. Para Clampex 8, primero debe crear un archivo de texto con el encabezado correspondiente. Debajo de la cabecera, inserte los incrementos de tiempo de un solo barrido en la primera columna. Los incrementos de tiempo debe tener el mismo espacio temporal como el intervalo de muestreo utilizados en las mediciones. Para cada barrido en el protocolo de paso de tensión insertar las tensiones exacta deseada en cada paso de tiempo. Esto debe incluir la función de ruido. </li></ol> 2. Realizar mediciones de tensión Clamp <ol><li> Crear un protocolo de medición en el software de adquisición que sea compatible con el archivo de estímulo generado previamente. En Clampex, hay un menú que permite al usuario asociar un archivo de estímulo con el protocolo actual. </li><li> Adjuntar un modelo (o biológicas) de células de los equipos de medición. </li><li> Realizar el experimento en la fecha prevista. A efectos de control, asegúrese de incluir mediciones periódicas que no incluyen ningún tipo de funciones de ruido. </li></ol> 3. El análisis post-Experimento <ol><li> Se calcula la curva IV para un registro individual. Si la grabación está en estado estacionario cuando la función de ruido se aplica, la curva IV pueden ser creados usando una parte el estado de equilibrio de la grabación temporalmente fuera del rango de la función de ruido. Si la grabación no se encontraba en estado estacionario, la función de ruido puede interferir con el cálculo de la curva IV, por lo que una segunda grabación se debe hacer sin la función de ruido presente. </li><li> Para cada escalón de tensión en una grabación de calcular la transformada rápida de Fourier de la parte de la grabación donde se introdujo la función de ruido. Combine la transformada de Fourier para cada escalón de tensión en amxn matriz, donde m es el número de frecuencias en la FFT, y n es el número de pasos de voltaje. En esta configuración, cada fila de la matriz representa la amplitud de una sola frecuencia en todas las etapas de tensión en el experimento. </li><li> Para cada frecuencia (es decir, cada fila de la matriz anterior) se correlacionan con la fila de la curva IV generada en 3.1 y registrar el coeficiente de correlación. </li><li> Parcela el coeficiente de correlación de frecuencia vs visualizar las frecuencias que se correlacionan altamente con la curva IV. Dado que el componente de CC está contenida dentro de la primera frecuencia de la FFT, el coeficiente de correlación para esta frecuencia siempre debe ser&gt; 0,99. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Representante de medidas con la pinza de voltaje se muestran en una celda sin modelo (Figura 1) y con (fig. 1B) una función de ruido se inserta en el protocolo de paso de tensión. La curva IV también se calculó para el modelo de células (fig. 1C). Para cada uno de barrido, en las grabaciones de la Figura 1, la FFT se calcula sobre el marco de tiempo donde se introdujo la función de ruido (véase el recuadro rojo en las figuras 1A, 1B). Las figuras 2A y 2B muestran la FFT calculada para las grabaciones se muestra en la Figura 1A y 1B, respectivamente. Tras la inspección visual, el componente de CC (en rojo) parece imitar la forma de la curva IV. Sin la función de ruido, todas las frecuencias por encima de DC parecen tener amplitudes cercanas a cero (Figura 2). Cuando la función de ruido se inserta, las frecuencias entre 1 y 15 kHz tienen amplitudes visualmente apreciable (Figura 2B). La Figura 3 muestra el resultado de la correlación de amplitudes de frecuencia individuales en el rango de medidas de tensión en la curva IV. Figura 3A-C muestra los coeficientes de correlación cuando el experimento se llevó a cabo bajo condiciones de control (sin función de ruido) y con una amplitud de ruido de 50 y 100 mV, respectivamente. Aviso en todos los casos, el componente de CC parece correlacionarse casi a la perfección con la curva IV. De hecho, para todas las grabaciones, el coeficiente de correlación para esta frecuencia fue mayor que 0,99 (R = 0,9996 ± 1E-5, media ± desviación estándar). Cuando nos fijamos en la Figura 3A (las condiciones de control), no hay frecuencias, además de la componente de CC, cuya amplitud se correlaciona significativamente con la curva IV. En concreto, ninguna de estas frecuencias tienen coeficientes de correlación superior a 0,5. Tras la inserción de la función de la amplitud de ruido más bajo (50 mV), estas mismas frecuencias todavía tenían coeficientes de correlación inferior a 0,5. Los coeficientes de correlación para lafrecuencias se también no llegó a ser superior a 0,5 cuando la amplitud del ruido se incrementó a 100 mV. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig1.jpg" alt="Figura 1" /> . Figura 1 grabaciones modelo de celular: Las grabaciones de pinza de voltaje se muestran en una celda sin modelo (1A) y (1B) una función de ruido incluido en el protocolo de paso de tensión. Para el primero y el último 20 ms de cada pasada, el potencial se mantuvo en el potencial de mantenimiento (0 mV). Cada escalón de tensión fue de 80 ms de largo, y la función de ruido se insertó 40 ms después del comienzo de la etapa. La función de ruido tuvo una duración de 30 ms y contenía frecuencias entre 1 y 15 kHz. Tensión se intensificó lado a otro, -150 a 50 mV en incrementos de 5 mV. Una curva IV para el modelo de células también se muestra (1C). Para realizar las grabaciones más fácil de leer, sólo uno de cada barrido quinto fue incluido en 1A y 1B, pero todos los barridos se incluyeron en 1C. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 FFT de las grabaciones:. La FFT se calcula para la parte de 30 ms de cada pasada, donde la función de ruido se va a insertar (el área delimitada por el cuadro rojo en las figuras 1A, 1B). Las figuras 2A y 2B muestran la FFT calculada con y sin la función de ruido, respectivamente. Una vez más, para mayor claridad, sólo la FFT de cada barrido quinto se incluye en la figura, pero todos los barridos se utilizaron en los cálculos futuros. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig3.jpg" alt="Figura 3" /> . Figura 3 Correlación de frecuencias IV: Los resultados de las correlaciones entre la curva IV de la grabación y la amplitud de las frecuencias individuales en el rango de medidas de tensión se muestra. Figuras 1A - 1C muestran el coeficiente de correlación de frecuencias entre 0 y 20 kHz en condiciones de control, y en presencia de 50 o 100 funciones de ruido mV, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4 Re-Creación de la curva IV:. La curva IV para el modelo de células (como en la figura 1C) y la magnitud de las dos frecuencias se superponen. La primera frecuencia fue el componente DC (R = 0,995), y la segunda fue una frecuencia elegida al azar, con baja correlación (r = 0.3212). Las amplitudes de frecuencia fueron reducidas a aproximadamente la misma amplitud que la curva IV.

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Hay obstáculos técnicos que actualmente impiden a los investigadores de la medición de múltiples tipos de canales iónicos de forma simultánea con la intención de posteriormente determinar la cantidad de corriente se debe atribuir a cada tipo de canal. Debido a esta limitación, los canales iónicos se estudian individualmente usando técnicas tales como tensión, corriente, y la acción pinza potencial. 1 Para el estudio de los distintos tipos de canales, sistemas de expresión heteróloga se utilizan con frecuencia. 2 Cuando se trabaja con células aisladas de tejido, como los cardiomiocitos , otros medios deben ser usados ​​para bloquear varios canales de iones. Por ejemplo, los canales de sodio puede ser inactivado por una rampa de tensión lenta despolarización, 3 hacia adentro rectificar los canales de potasio puede ser bloqueado con BaCl2 extracelular, 4 canales de calcio y pueden ser bloqueados con verapamilo 5. Una de las prácticas que en parte supera esta limitación es para medir el flujo de corriente a través de dos tipos de canales de forma simultánea, y luego repetir la medición después de bloquear selectivamente un tipo de canal con un agente apropiado. La resta de las dos mediciones se pueden utilizar para estimar la cantidad de corriente atribuible al tipo de canal que fue bloqueado. 6 Sin embargo, hay dos grandes limitaciones de esta técnica. En primer lugar, los agentes químicos no han sido identificados que pueden bloquear de forma selectiva cada uno de los canales iónicos, y algunas drogas utilizadas son interacciones no específicas con los tipos de canal. 5,7 segundo lugar, no puede determinarse a partir de esta técnica si un canal está modulada por otra canal. Por ejemplo, la expresión heterogénea de NAV 1.5 y Kir 2.1 ha demostrado en Guinea ventrículos cerdo, y se ha sugerido que existe una relación sinérgica entre los dos canales, de tal manera que Kir 2,1 mayor expresión en el ventrículo derecho deprime la velocidad de conducción. Actualmente 8 , esto no puede ser verificada. En este estudio, sugieren que la espectroscopía de impedancia puede ser una herramienta útil para el estudio de múltiples tipos de canales de iones medidos de forma simultánea. Aunque el método presentado no ha sido utilizado para discernir las corrientes a partir de dos tipos de canales miden simultáneamente, espectroscopía de impedancia se ha utilizado para estudiar una serie de otros aspectos de la función del canal iónico. Goodman y el arte con la tortuga mostró células ciliadas auditivas que los protocolos de corriente con la pinza se puede modificar para ajustar una celda a diferentes frecuencias, y las oscilaciones en el potencial de membrana se debe a una interacción entre un adentro rectificar canal de K + y un canal de Ca 2 +. 9 Han y Frazier demostrado que la impedancia se puede medir en una sola célula en un amplio rango de frecuencias (100 Hz a 5 MHz), y el aumento de la impedancia observada en K + o Ca 2 + canales estaban bloqueados podría ser un simple medio para detectar un bloqueo en el canal de pantallas de alta rendimiento de drogas. 10 Hayashi y Fishman ha utilizado la conductancia complejas para estudiar las propiedades cinéticas de una rectificación de K + hacia el interior del canal 11. Otros grupos han insertado una sola frecuencia en el protocolo de fijación de voltaje de los tipos de canales diferentes y demostró que la respuesta en frecuencia observada de acuerdo con la respuesta esperada para algunas frecuencias, pero otras no. 12,13 Millonas y Hanck sugiere la razón algunas frecuencias no se produce la respuesta esperada es la presencia de constantes de tipo de interés múltiple en el modelo de Markov. 12 Estudios como estos, así como otros, han demostrado que hay casos en que las corrientes iónicas medidas de los canales iónicos durante el uso de espectroscopía de impedancia no está de acuerdo con la respuesta de frecuencia teórica. Esto no es una preocupación en este estudio debido a que el objetivo del método en este estudio es identificar las frecuencias que se corresponden con la amplitud de la corriente independiente de los supuestos del circuito eléctrico de membrana. Furtheremore, la amplitud de la corriente se calcula a partir de porciones de las grabaciones que no tienen funciones de ruido inserta en ellos. Un número de otros estudios también los modelos actuales de los canales iónicos exhiben numerosos numerosos estados la realización de la conducción y no a todos con sus constantes de velocidad propia. 14,15,16 Thompson et al demostraron que el filtro de selectividad del canal KcsA tiene diferentes sitios de unión de Na +, Li + y K +, y los costes energéticos de moverse de un sitio de unión a los otros como se mueve un ion a través del filtro de selectividad es lo que hace el canal de preferencia realizar iones K + a través de sus poros. 17 En el presente trabajo se inserta una amplia de frecuencias (función de ruido) en un protocolo de paso de tensión y buscó las frecuencias, cuya amplitud altamente correlaciona con la amplitud de la corriente general. Desde una fuerte evidencia ha sido presentada sugiere varias constantes tasa de desempeñar un papel en la conducción de iones a través de difet los canales, la introducción de las frecuencias asociadas a estas constantes de velocidad pueden causar ciertas frecuencias de resonancia o altamente correlaciona con la amplitud de la corriente, que no habría otra manera. La técnica demostrada en este estudio se realiza sobre un modelo de células, que es un circuito paralelo RC que normalmente se utiliza para probar el circuito de fijación de voltaje y el equipo de adquisición. No se espera que las frecuencias, además de CC se correlaciona con la magnitud actual, y esto se muestra en nuestros datos. También muestran que la adición de la función de ruido no causa ningún frecuencias para correlacionar altamente con la amplitud de la corriente. Estos dos hallazgos son muy importantes porque demuestran que el equipo de medición y la función del ruido de por sí no causa ningún frecuencias que se correlaciona con la amplitud de la corriente. Cuando los estudios futuros efectúe las mediciones con las membranas que contienen los canales de iones, se espera que, en función del canal utilizado, las frecuencias que corresponden a las constantes de velocidad en el filtro de selectividad o, posiblemente, de los poros de la influirán en la respuesta de frecuencia del canal y afectan a las frecuencias que tienen un alto o una baja correlación con la amplitud de la corriente. Dado que este método es una nueva técnica para el estudio de los canales iónicos, hay una serie de direcciones futuros estudios podrían seguir. En primer lugar, la técnica debe ser utilizado para caracterizar la respuesta de frecuencia de determinados canales aislados. El trabajo adicional también hay que hacer para calibrar la amplitud de la frecuencia de las amplitudes de corriente. Una vez que los canales múltiples se caracterizan individualmente, varios tipos de canal se debe medir de forma simultánea. La técnica también podría ser adaptado para su uso en la abrazadera del potencial de acción, pinzas de corriente, y los estudios de campo de estimulación. Si bien esta es una nueva técnica, que muestra lo que puede ser una poderosa manera de hacer las mediciones electrofisiológicas que anteriormente no eran posibles y proporcionar valiosos nuevos conocimientos sobre el papel fisiológico de los canales iónicos.

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<td>Mathworks</td>
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<td>Clampex 8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Clampex 8</td>
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</tr>
<tr>
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<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Axopatch 200</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Headstage</td>
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<td>Molecular Devices</td>
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<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>16-Bit Data Acquisition System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Digidata 1322A</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Model Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Patch 1 Model Cell</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

recapitulation of an ion channel iv curve using frequency components

INTRODUCCIÓN: En la actualidad, no existen métodos establecidos para medir varios tipos de canales iónicos y se descomponen al mismo tiempo la corriente medida en porciones atribuibles a cada tipo de canal. Este estudio demuestra cómo espectroscopía de impedancia puede ser utilizado para identificar frecuencias específicas que se correlaciona altamente con la amplitud de la corriente de estado estacionario medida durante los experimentos de fijación de voltaje. El método consiste en insertar una función de ruido contiene frecuencias específicas en el protocolo de paso de tensión. En el trabajo presentado, una célula modelo se utiliza para demostrar que no hay una alta correlación son introducidos por los circuitos de fijación de voltaje, y también que la función de ruido en sí no presenta ninguna correlación alta cuando no hay canales de iones están presentes. Esta validación es necesaria antes de que la técnica puede aplicarse a los preparados que contienen los canales de iones. El objetivo del protocolo que se presenta es para demostrar la forma de caracterizar la respuesta en frecuencia de un tipo de canales iónicos individuales a una función de ruido. Una vez que las frecuencias se han identificado en un tipo de canal individual, que puede ser usado para reproducir el estado de equilibrio actual de tensión (IV) la curva. Las frecuencias que se correlacionan con gran tipo de canal y una mínima correlación con los tipos de otro canal se puede utilizar para estimar la contribución actual de los tipos de canales múltiples medidas simultáneamente. MÉTODOS: Las mediciones de voltaje clamp se realizaron en un modelo de células utilizando un protocolo estándar de tensión de paso (-150 a +50 mV, 5mV pasos). Funciones de ruido que contienen magnitudes iguales de 15.1 kHz frecuencia (de cero a amplitudes de pico: 50 o 100 mV) se inserta en cada escalón de tensión. El componente real de la Transformada Rápida de Fourier (FFT) de la señal de salida se ha calculado con y sin ruido para cada posible paso. La magnitud de cada frecuencia en función de la tensión de paso se correlaciona con la amplitud de la corriente en los voltajes correspondientes. Resultados y conclusiones: En la ausencia de ruido (control), las magnitudes de todas las frecuencias excepto el componente DC débil correlación (| R | &lt;0,5) con la curva IV, mientras que el componente de CC tuvo un coeficiente de correlación superior a 0,999 en todas las mediciones. La calidad de la correlación entre las frecuencias individuales y la curva IV no cambió cuando una función de ruido fue introducido en el protocolo de paso de tensión. Del mismo modo, el aumento de la amplitud de la función de ruido tampoco aumentar la correlación. Medidas de control demuestra que el circuito de fijación de voltaje por sí misma no causa ningún frecuencias por encima de 0 Hz a correlacionan altamente con la curva en estado estacionario IV. Del mismo modo, las mediciones de la presencia de la función de ruido demostrar que la función de ruido no causa ningún frecuencias por encima de 0 Hz a correlacionarse con la curva en estado estacionario IV cuando no hay canales de iones están presentes. En base a esta verificación, el método puede aplicarse ahora a los preparados que contienen un tipo de iones de un solo canal con la intención de identificar las frecuencias cuyas amplitudes se correlaciona específicamente con ese tipo de canal.

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Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

Hay obstáculos técnicos para la medición de flujo de corriente a través de los canales iónicos de forma simultánea, y luego discernir qué parte de la corriente transmembrana se debe a que cada tipo de canal. Para satisfacer esta necesidad, este método presenta una forma de generar la curva IV de los tipos de canal individual utilizando componentes de frecuencias específicas.

Recapitulación de una curva de canal iónico IV Uso de componentes de frecuencia

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

recapitulation-of-an-ion-channel-iv-curve-using-frequency-components

Research

JoVE Journal

Biology

13.4K vistas.  University of Utah. Hay obstáculos técnicos para la medición de flujo de corriente a través de los canales iónicos de forma simultánea, y luego discernir qué parte de la corriente transmembrana se debe a que cada tipo de canal. Para satisfacer esta necesidad, este método presenta una forma de generar la curva IV de los tipos de canal individual utilizando componentes de frecuencias específicas.

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MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

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The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagénesis dirigida casera de plásmidos enteros

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

Cuantificar la frecuencia de tumores se propagan las células usando trasplante de células limitación de dilución en el pez cebra singénico

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Exploración del músculo liso arterial KV7 función del canal de potasio mediante electrofisiología Patch Clamp y miografía presión

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Reconstitución de una proteína transmembrana, el canal iónico dependiente de voltaje, KvAP, en Gigante vesículas unilamelares para Microscopía y Patch Clamp Estudios

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Caracterización funcional de Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Intercambiadores de compartimentos intracelular usando selección Protón-matanza para expresarlos a la membrana plasmática

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Medición de la extracelular Ion fundentes Uso del referencias Ion selectivo microelectrodos Técnica

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

La visualización de frecuencia Stromule con microscopía de fluorescencia

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...