Damos las gracias al Alvin J. Siteman Cancer Center en la Universidad de Washington Escuela de Medicina y Barnes-Jewish Hospital en St. Louis, MO, por el uso del Núcleo clasificador de alta velocidad de la célula, que proporcionó el equipo de citometría de flujo y los servicios de clasificación. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R01 HL082549 HL084179 y K02 (NRY). El Siteman Cancer Center es apoyado en parte por un apoyo del NCI Cancer Center de Grant P30 CA91842.

1. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS <ol><li> Preparar soluciones estériles acciones 1000x de Fms relacionados con la tirosina quinasa 3 (FLT-3) ligando, de granulocitos / macrófagos factor estimulante de colonias (GM-CSF), factor de células madre (SCF), trombopoyetina (TPO), la interleuquina (IL) -3 , y la IL-6 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Prepare una solución estéril de acciones Retronectin (1mg/ml), también de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Divide estas soluciones madre en pequeñas alícuotas y mantener a -20 ° C para evitar repetidos de congelación-descongelación. </li><li> Prepare FBS al 2% en IMDM. </li><li> Preparar el medio IMDM completo con una concentración final de 20% de SFB, 2 mM de glutamina, 100 unidades / ml penicilina / estreptomicina (PS). Añadir las citoquinas siguiente justo antes de su uso: 100 ng / ml ligando FLT-3, 20 ng / ml de GM-CSF, 100 ng / ml de SCF, 100 ng / ml TPO, 50 ng / ml de IL-3, y 100 ng / ml IL-6. </li><li> Prepare un 1% de BSA en HBSS (Ca y Mg libre, sin rojo fenol) y el 2% de BSA en D-PBS (Ca y Mg libre). Esterilizar las soluciones al pasar por filtros de 0,22 micras jeringa y se almacenan a 4 ° C. </li><li> Prepare un 0,02% de EDTA en HBSS y se almacenan a 4 ° C. </li><li> Prepare Galv-pseudotyped retrovirus que codifica el ADN de interés y almacenar en alícuotas a -80 ° C. Este procedimiento está fuera del alcance de este artículo, pero es descrito en otra parte (1-3). </li></ol> Para la tinción Giemsa <ol start="7"><li> Justo antes de su uso, filtrar la solución Wright / Giemsa dos veces a través de un filtro de documentos micras en una botella de vidrio limpia. </li><li> Inmediatamente antes de su uso, preparar Wright / Giemsa buffer pH 6,4, mediante la mezcla de 50 ml del filtrado Wright / Giemsa solución de tinción y 200 ml de solución tampón fosfato, pH 6,4 - Giordano fórmula. </li><li> Prepare una solución de tampón fosfato, pH 6,0 mediante la disolución de 27,3 g de KH 2 PO 4 y 4,62 g de Na 2 HPO 4 en el 3,5 LH 2 O. </li><li> Prepare un 50% de metanol en H 2 O. </li></ol> 2. PROCEDIMIENTO Descongelación y la pre-activación de las células CD34 + <ol><li> Descongelar un vial de células CD34 + congelados rápidamente a 37 ° C agitando suavemente hasta que el último cristal de hielo delgado es la izquierda y la transferencia de la suspensión celular (1 ml) a un tubo cónico de 50 ml. Enjuague suavemente fuera de las células restantes del vial con 1 ml de la temperatura ambiente del 2% de SFB / IMDM y añadir gota a gota en el tubo de 50 ml, mientras agita suavemente. Espere 3 minutos. A continuación, añada lentamente 2 ml de 2% de SFB / IMDM, mientras se mezcla suavemente, y esperar durante 3 minutos. Repita el procedimiento mediante la adición de 2% de SFB / IMDM que es el mismo volumen que la suspensión celular diluida en intervalos de 3 minutos, revolviendo suavemente entre las adiciones, hasta que el volumen final alcanza los 32 ml. </li><li> Centrifugar a 250 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente y separar el sobrenadante dejando alrededor de 0,5 ml. </li><li> Lavar el sedimento en suspensión en 20 ml 2% de SFB / IMDM y centrifugado a 200 xg durante 8 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el sobrenadante y suspender las células en medio IMDM completo en aproximadamente 0,5 x 10 6 células / ml. Tomar 10 l de la suspensión celular en un microtubo, mezclar con el mismo volumen de solución de azul tripán (0,4%) y contar con un hemocitómetro. </li><li> Diluir las células de 0,1-0,15 x 10 6 células / ml mediante la adición de medio IMDM completo suplementado con las citoquinas (ver 1.3) </li><li> Cultivar las células en un humidificado incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 2 días. </li></ol> Transducción retroviral por el virus de pre-carga <ol start="7"><li> En el día de la transducción, las células antes de iniciar el conteo de virus precarga para determinar el número de pozos que estar preparado. </li><li> Diluir la solución madre Retronectin a 25 mg / ml y añadir 400 l de cada pocillo de una de 24 y no tratados con placa de cultivo de tejidos. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente en la campana de flujo laminar de bioseguridad para pre-capa. </li><li> Eliminar la solución Retronectin y añadir 400 l de BSA al 2% en D-PBS en cada pocillo. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Descongele soluciones virus de valores y mantener en hielo. Eliminar la solución de BSA, se añaden 0,5 ml de la preparación de virus a cada pocillo, y se centrifuga a 2200 xg a 4 ° C durante 15 minutos. </li><li> Retire la solución de virus de los pozos y repita la carga de virus descritos en 2.10 tres veces más. </li><li> Enjuague bien con agua fría cada HBSS 0,5 ml (+ Ca y Mg) o IMDM. </li><li> Recoger la pre-activado las células CD34 + por centrifugación a 200 xg durante 8 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Resuspender las células en 0,1-0,15 x 10 6 células por 1,5 ml en medio IMDM completo con citoquinas. </li><li> Añadir 1,5 ml de suspensión celular a cada pocillo y se incuba en un humidificado incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 2 días. </li></ol> Clasificación de células y la recolección de las células transducidas <ol start="16"><li> Suave pero completamente suspender las células en los anteriores virus de los platoss, y filtrar a través de un filtro de 50 micras de células CellTrics en un tubo cónico. Tomar 10 l de la suspensión celular en un microtubo, mezclar con un volumen igual de solución de azul tripán y contar con un hemocitómetro. Enjuague bien cada uno con 0,8 ml de EDTA 0,02% frío / HBSS (Ca y Mg libre sin rojo fenol) y añadir al tubo de la misma colección a través de un filtro de 50 micras de células CellTrics. </li><li> Centrifugar las células a 200 xg durante 8 minutos a 4 ° C, y lavar el precipitado con agua fría HBSS (Ca y Mg libre sin rojo fenol) por centrifugación a 200 xg durante 8 minutos a 4 ° C. </li><li> Resuspender el precipitado en 1% de BSA / HBSS (Ca y Mg libre sin rojo fenol) a una concentración de 15 x 10 6 / ml o un volumen mínimo de 0,250 ml de células de clasificación. Mantener las células en hielo en la oscuridad. Preparar un tubo que contiene 20% de SFB frío / IMDM / Glutamina / PS medio para la recogida de células seleccionadas. La clasificación se realiza en el Centro Clasificador de alta velocidad de la célula de la Alvin J. Siteman Cancer Center en la Universidad de Washington Escuela de Medicina con un MoFlo clasificador de alta velocidad (Dako, Glostrup, Dinamarca). </li></ol> CFC ensayo <ol start="19"><li> Descongele el número requerido de 3 ml alícuotas de los medios de prueba de CFC. Agitar vigorosamente para mezclar y dejar que los tubos de soporte por lo menos 5 minutos a que todas las burbujas presentes a subir a la superficie antes de añadir las células. </li><li> Para obtener la concentración de células para cada muestra ordenada, divide el número de células proporcionada por la planta de clasificación por el volumen de suspensión celular aproximados. Tome 3.000 virus transducidas células seleccionadas en un microtubo estéril que contiene 2% de SFB frío / IMDM. Pre-ajustar el volumen de 2% de SFB / IMDM de modo que el volumen de suspensión definitiva será de aproximadamente 0,3 ml. </li><li> Suspender las células y la transferencia de la totalidad de 0,3 ml de suspensión celular a una alícuota de 3 ml de Methocult GF + H4435, que consiste en metilcelulosa al 1%, 30% de SFB, 1% BSA, 10 -4 M de 2-mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina, 50 ng / ml de SCF, de 20 ng / ml de GM-CSF, 20 ng / ml de IL-3, 20 ng / ml de IL-6, 20 ng / ml de G-CSF, y 3 unidades / ml de eritropoyetina en IMDM. Humanos metilcelulosa enriquecido Media (R &amp; D Systems), que consta de 1,3% de metilcelulosa, un 25% de SFB, 1% de BSA, 5 x 10 -5 M 2-mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina, 50 ng / ml de SCF, de 20 ng / ml de GM-CSF, 20 ng / ml de IL-3, 20 ng / ml de IL-6, 20 ng / ml de G-CSF, y 3 unidades / ml de eritropoyetina en IMDM también se puede utilizar. </li><li> Agitar vigorosamente para hacer la mezcla totalmente aumento y la caída 3-4 veces. Deje que el tubo de detenerse durante 3 min. </li><li> Adjunte una calibre 16 de extremo romo aguja a una jeringa de 3 ml y elaborar 2,2 ml. No elaborar las burbujas grandes, expulsarlos al inicio pulsando un par de veces. Empuje de 1,1 ml cada una en dos de 30 mm no tratados plato y repartir la mezcla de manera uniforme por la rotación. </li><li> Colocar placas duplicadas en una placa de 100 mm con un plato de agua que contiene 3 ml de agua estéril. Cultura de 14 a 17 días. </li><li> Caracterización y calificación de las colonias de acuerdo a su morfología con un microscopio invertido con un aumento de 40x en una placa de cultivo marcada con una cuadrícula de puntuación. A los efectos de nuestro análisis, las colonias se clasifican en tres categorías: eritroide pura, mielomonocítica y mixto. Consulte las instrucciones del fabricante para la subclasificación colonia más. </li><li> La placa de CFC ensayo completo se puede escanear sin ampliación mediante un escáner regulares a 600 dpi, y de baja potencia (40x) microfotografías de las colonias pueden ser tomadas con un microscopio invertido equipado con una cámara a color. </li><li> Para su posterior análisis de la diferenciación y la proliferación de las células de la placa de CFC ensayo completo se recuperan mediante la suspensión de varios volúmenes de la temperatura ambiente del 2% de SFB / IMDM. Después de la centrifugación a 300 xg durante 10 min a 4 ° C, las células se resuspenden en FBS al 2% / IMDM, contados, y, o bien teñidas con anticuerpos para citometría de flujo o transferidos a las diapositivas utilizando una centrifugadora Cytospin para la tinción de Giemsa. </li></ol> Tinción de anticuerpos y citometría de flujo <ol start="28"><li> Las células se centrifugan a 200 xg durante 8 minutos a 4 ° C y resuspender en frío un 50% de suero normal de ratón en HBSS (Ca y Mg libre sin rojo fenol). </li><li> Colocar aproximadamente 5 x 10 5 células en 80 l por tubo (12 x 75 mm de fondo redondo de tubos) y mantener en hielo. Agregue la mezcla de anticuerpos (aproximadamente 20 l mezcla o solución de control negativo para los controles de no-anticuerpo) y se mezcla con ligeros golpes en los tubos. Prepare los tubos de calibración de control sin anticuerpos o con un anticuerpo anti-CD45 para cada fluorocromo. Se colocan los tubos en hielo en la oscuridad y se incuba durante 20 minutos. Mezclar con ligeros golpes en los tubos después de los primeros 10 minutos. Después de la incubación de 20 minutos, llenar los tubos con HBSS frío y centrifugar a 200 xg durante 8 minutos a 4 ° C. Resuspender el precipitado en paraformaldehído frío 0,5% / HBSS. Las siguientes mezclas de anticuerpos se utilizan normalmente para nuestro análisis. Para la diferenciación mieloide: CD11b (ficoeritrina conjugado clon ICRF44) / CD33 (allophycocyanin conjugado clon WM53) / CD45 (ficoeritrina Cy7-congjugated clon HI30). Para la diferenciación eritroide: CD71 (ficoeritrina conjugado clon M-A712) / CD235a (aloficocianina conjugado clon GA-R2) / CD45 (ficoeritrina Cy7-congjugated clon HI30). </li><li> La citometría de flujo se lleva a cabo en el Centro clasificador de alta velocidad de la célula de la Alvin J. Siteman Cancer Center en la Universidad de Washington Escuela de Medicina en un citómetro de flujo FACScan actualizado a 5 colores y dos láseres (BD Biosciences) y se analizaron mediante CellQuest (BD Biosciences) o FlowJo v7.2.4 (Árbol Star, Inc., Ashland, Oregón, EE.UU.) de software. </li></ol> La coloración de Giemsa <ol start="31"><li> Aproximadamente 30.000 células recuperadas de las placas de ensayo de CFC se ha descrito anteriormente se suspendió en 0,3 ml 2% de SFB / IMDM y trasladado a una diapositiva utilizando una centrifugadora Cytospin a 1.000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Establecido nueve buques tinción con soluciones en el siguiente orden. <ol><li> El metanol absoluto </li><li> Wright / Giemsa solución madre </li><li> Wright / Giemsa, pH 6,4 </li><li> 50% de metanol en H 2 O </li><li> H 2 O </li><li> H 2 O </li><li> Tampón fosfato, pH 6,0 </li><li> H 2 O </li><li> H 2 O </li></ol></li><li> Colocar los portaobjetos en un soporte de diapositivas y la inmersión en metanol absoluto (# 1) durante 2 minutos y secar fuera el exceso de metanol. </li><li> Inmediatamente, sumergir el soporte de diapositivas en Wright / Giemsa solución madre (# 2) durante 5 min. </li><li> La transferencia de la compañía en Wright / Giemsa, pH 6.4 (# 3) y se incuba durante 10 min. </li><li> Sumerja el transporte dos veces en metanol al 50% (# 4), 10 veces en H 2 O (# 5), otras 10 veces en H 2 O (# 6), y luego 5 veces con tampón fosfato, pH 6.0 (# 7) . </li><li> La transferencia de la compañía en H 2 O (# 8) y se incuba durante 2 min. Repita el lavado de H 2 O (# 9). </li><li> Permita que las diapositivas se seque al aire completamente en el vehículo. Eliminar todas las diapositivas y limpie la parte posterior de la diapositiva con empapado de metanol Kimwipes para eliminar las manchas. Coloque una gota de Cytoseal 60 y una cubierta de vidrio para sellar. </li><li> Un recuento diferencial de 500 células se realiza para cada diapositiva de Giemsa utilizando un microscopio Olympus BX51. Las células se dividen en cinco categorías: células primitivas son blastos ni promielocitos, células intermedias mieloide incluyen mielocitos y metamielocitos; células maduras mieloide incluyen bandas, neutrófilos segmentados, monocitos y macrófagos, células intermedias incluyen las células eritroides con hemoglobinization intermedios, y son maduros células eritroides células con hemoglobinization completo. Fotomicrografías se toman con una cámara Olympus DP71, con un objetivo de aceite 60x. </li></ol> 3.0) Los resultados representativos: <ol><li> Ensayo de CFC: Parte de la población celular de entrada va a proliferar, diferenciarse y formar colonias en el medio semi-sólido durante el período de incubación de 14 a 17 días. En este experimento, es evidente que la expresión del oncogén Nup98-Hoxa9 causó la formación de prominentes rojo (colonias eritroides) (Figura 1) (3). </li><li> La tinción de anticuerpos y citometría de flujo: inmunofenotipo por citometría de flujo de las células obtenidas a partir de placas de ensayo CFC proporciona información sobre el estado de diferenciación de la población de células. El uso combinado de anticuerpos frente a ciertos marcadores de diferenciación, el linaje y el grado de maduración de las células puede ser evaluada. En este caso CD235a se utilizó para identificar las células eritroides. Como se muestra en la Figura 2A, Nup98-Hoxa9 provocado un aumento en el porcentaje de CD235a + células eritroides, pero el brillo de expresión CD235a por estas células se disminuyó en comparación con los controles, lo que indica la inhibición de la maduración eritroide. En la Figura 2B, las células mieloides se identifican en virtud de su positividad CD33. Nup98-Hoxa9 causó una disminución en el número de células CD33 +, con una disminución en el brillo de expresión CD11b, en consonancia con la inhibición de la maduración mieloide (3). Así, los resultados muestran que la citometría de flujo Nup98-Hoxa9 causado una hiperplasia eritroide con la inhibición de la maduración tanto mieloides y eritroides. </li><li> La tinción de Giemsa: El examen morfológico de células obtenidas a partir de placas de ensayo CFC proporciona información sobre el linaje y el grado de maduración de la población de células. Las conclusiones obtenidas morfológicamente pueden diferir de los obtenidos por los estudios de citometría de flujo, y por lo tanto estos métodos son complementarios entre sí (3). El experimento se repitió al menos tres veces, y cada vez que un recuento diferencial de 500 células se realiza para distinguir cinco categorías de células como se describió anteriormente. Ejemplos de estas células se señalan en la figura 3. Los resultados son tabulados y analizados con el fin de determinar si existen diferencias estadísticamente significativas entre el oncogén transducidas de la muestra y el control. En este caso, los resultados mostraron que Nup98-Hoxa9 causado un aumento global del números de las células, con hiperplasia eritroide y la inhibición de los eritrocitos y la maduración mieloide (3) (no se muestra). </li></ol> LEYENDAS DE FIGURA <img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Los efectos de la Nup98-Hoxa9 CFC en la morfología humana. Primaria humanos células CD34 + fueron transducidas retroviralmente, ya sea con el control MSCV-IRES-GFP vector o vector de expresión de Nup98-Hoxa9, y las células fueron ordenados por la positividad de las buenas prácticas agrarias. Mil células fueron sembradas en cada una de las dos placas duplicadas para el ensayo de CFC y el experimento se repitió tres veces cuatro independientes. Placas representativas sin amplificación (izquierda) y microfotografías de baja potencia del representante colonias eritroides (derecha) se muestra (3). <img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: La citometría de flujo muestra la interrupción de los derechos humanos primarios CD34 + diferenciación de las células por Nup98-Hoxa9. (A) La citometría de flujo para la diferenciación eritroide: Las células de las placas de CFC (ver Figura 1) se cosecharon y se tiñeron con anticuerpos CD45 y CD235a. El CD235a + puerta se representa en un histograma (panel derecho) para mostrar la expresión de CD235a en relación con las células control (B) por citometría de flujo para la diferenciación mieloide: Las células de las placas de CFC fueron cosechadas y se tiñen con CD45 y CD33. El CD33 + puerta se representa en un histograma para mostrar la expresión de CD11b en comparación con el control (panel derecho). Los porcentajes de células que entran en cada puerta se muestra (3). <img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: La morfología celular muestra la interrupción de la diferenciación por Nup98-Hoxa9 en comparación con el control de vectores. Frotis Cytospin fueron preparados a partir de placas de CFC y se tiñeron con Giemsa. Fotomicrografías fueron tomadas de campos representativos con un objetivo de aceite de 60x. B: explosión; MM: mieloide madura, IM: mieloide intermedios, ME: madura eritroides, IE: intermedio eritroides (3).

<ol>
	<li>Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9+induces+long-term+proliferation+and+blocks+differentiation+of+primary+human+CD34++hematopoietic+cells.">NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells.</a> Cancer Res. , 66-6628 (2006).</li><li>Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+NUP98-DDX10+oncogene+on+primary+human+CD34++cells:+role+of+a+conserved+helicase+motif.">Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif.</a> Leukemia. , (2010).</li><li>Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+transformation+of+primary+human+hematopoietic+cells+by+the+oncogene+NUP98-HOXA9.">Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9.</a> PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).</li><li>Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hematopoietic+colonies+in+health+and+disease.">Human hematopoietic colonies in health and disease.</a> Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).</li><li>Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+colony-forming+cell+assays.">Hematopoietic colony-forming cell assays.</a> Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).</li><li>Coulombel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hematopoietic+stem/progenitor+cells:+strength+and+drawbacks+of+functional+assays.">Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays.</a> Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).</li><li>Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection,+maintenance,+and+differentiation+of+primitive+human+hematopoietic+cells+in+cultures+containing+murine+fibroblasts+engineered+to+produce+human+steel+factor,+interleukin-3,+and+granulocyte+colony-stimulating+factor.">Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor.</a> Blood. 88, 3765-3773 (1996).</li></ol>

El ensayo de CFC se ha utilizado ampliamente para determinar la proliferación y diferenciación de los patrones de progenitores hematopoyéticos y para estudiar los efectos de los oncogenes (4, 5). Tiene la ventaja sobre los cultivos líquidos de ser un ensayo clonal, de tal manera que las colonias representan la progenie de un solo progenitor y puede ser eliminado de forma individual para su posterior análisis. La limitación de la prueba de CFC es que no es adecuado para la detección de los progenitores más inmadu...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>IMDM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Technologies</td>
<td>12440</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>06150</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Technologies</td>
<td>25030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin (PS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Technologies</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FLT-3 ligand</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>300-19</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GM-CSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>300-03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SCF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>300-07</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TPO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>300-18</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IL3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>200-03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IL6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>200-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma- Aldrich</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP118</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Retronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Takara Bio Inc</td>
<td>T100A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Technologies</td>
<td>14175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Technologies</td>
<td>14200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypan Blue solution (0.4%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8154</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methocult GF+ H4435</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>04445</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human Methylcellulose Enriched Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R &amp; D Systems</td>
<td>HSC005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wright/ Giemsa stain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harleco</td>
<td>64571</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 - Giordano formula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical Company</td>
<td>1450</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A412-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal 60</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>8310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Mouse Serum </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rockland Immunochemicals</td>
<td>D208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>555388</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>551378</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>557748</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>555537</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>551336</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>557748</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24-well non-treated tissue culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>35-1147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30 mm non-treated dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>27150 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 mm tissue culture dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-757-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gridded scoring dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>27500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 ml centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>35-2097</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>35-2070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringes 3 ml </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>28240</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>16 gauge blunt-end, 1&frac12; inch needle </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>28110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 &mu;m CellTrics cell filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Partec</td>
<td>04-004-2327</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hemocytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>0267110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TPX sample chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>A78710018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-550-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon filter cards</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>5991022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon cytospin slide holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>59920063</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon Complete Staining Assembly 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kimwipes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kimberly-Clark Corporation</td>
<td>34155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 &mu;m filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>28307-134</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inverted microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>Diaphot</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>DS-F11</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>BX51 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>DP71</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scanner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microtek</td>
<td>Scanmaker 4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vortex mixer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-812</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue culture incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sanyo</td>
<td>MCO-18AIC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytospin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon</td>
<td>Cytospin 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bench-top centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5810-R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water purification system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Barnstead</td>
<td>Nanopure-Diamond</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

colony forming cell (cfc) assay for human hematopoietic cells

Hematopoyéticas humanas células madre / progenitoras se obtienen generalmente de la médula ósea, sangre del cordón umbilical o sangre periférica y se utilizan para estudiar la hematopoyesis y leucemogénesis. Tienen la capacidad de diferenciarse en linajes linfoides y mieloides. La formación de colonias de células (CFC) de ensayo se utiliza para estudiar la proliferación y el patrón de diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas de su capacidad de formar colonias en un medio semisólido. El número y la morfología de las colonias formadas por un número fijo de células de entrada proporcionan información preliminar sobre la capacidad de los progenitores para diferenciarse y proliferar. Las células pueden ser cosechadas a partir de distintas colonias de la placa entera para evaluar aún más sus números y los estados de diferenciación mediante citometría de flujo y la evaluación morfológica de Giemsa diapositivas. Este ensayo es útil para evaluar la diferenciación mieloide linfoide, pero no. El mieloide término en este contexto se utiliza en su sentido más amplio para abarcar linajes granulocítica, monocítica, eritroide y megacariocítica. Hemos utilizado este ensayo para evaluar los efectos de los oncogenes en la diferenciación de las células humanas primarias CD34 + derivadas de sangre periférica. Para este propósito las células se transducen con la construcción de control, ya sea por retrovirus o un concepto que expresa el oncogén de interés, en este caso-Nup98 Hoxa9. Contamos con un vector retroviral de uso común, MSCV-IRES-GFP, que expresa un mRNA bicistrónico que produce el gen de interés y un marcador GFP. Las células son pre-activado por el aumento en la presencia de citocinas durante dos días antes de la transducción retroviral. Después de dos días, las células GFP + se encuentran aisladas por la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y se mezcla con un medio semisólido que contiene metilcelulosa, complementado con las citocinas y se incuban hasta que las colonias aparecen en la superficie, por lo general 14 días. El número y la morfología de las colonias están documentados. A continuación se retiran las células de las placas, se lavan, se cuentan y sometidos a la citometría de flujo y el examen morfológico. La citometría de flujo con anticuerpos específicos para los marcadores de superficie celular expresadas durante la hematopoyesis proporciona información sobre el linaje y la etapa de maduración. Los estudios morfológicos de las células individuales bajo un microscopio después de Wright-Giemsa tinción de proporcionar más información con respecto a la descendencia y la maduración. Comparación de las células transducidas con el vector de control de vacío a los transducidas con un oncogén revela los efectos del oncogen en la diferenciación hematopoyética.

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Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

La formación de colonias de células (CFC) de ensayo es un ensayo in vitro en progenitores hematopoyéticos que forman colonias en un medio semi-sólido. Una combinación de la morfología de la colonia, la morfología celular y citometría de flujo se utilizan para evaluar la capacidad de los progenitores para proliferar y diferenciarse a lo largo de los diferentes linajes hematopoyéticos.

La formación de colonias de células (CFC) para el ensayo de células hematopoyéticas humanas

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

colony-forming-cell-cfc-assay-for-human-hematopoietic-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

35.4K vistas.  Washington University School of Medicine. La formación de colonias de células (CFC) de ensayo es un ensayo in vitro en progenitores hematopoyéticos que forman colonias en un medio semi-sólido. Una combinación de la morfología de la colonia, la morfología celular y citometría de flujo se utilizan para evaluar la capacidad de los progenitores para proliferar y diferenciarse a lo largo de los diferentes linajes hematopoyéticos.

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Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Generación de células T Multivirus específicos para prevenir / tratar las infecciones virales después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Investigación

Inmunología e Infección

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

A raíz de la celda de destino en<em&gt; E. coli</em&gt; Después de la infección por fagos Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

El uso de interferón-γ enzimo-inmunoensayo para la Caracterización de Nuevos epítopos de células T del virus del papiloma humano

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposón modificación del sistema de células T humanas primarias

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

La identificación de mutaciones del ADN en Purificada hematopoyéticas células madre / progenitoras

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Killer Artificial células presentadoras de antígenos (KaAPC) para la utilización eficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; El agotamiento de células T humanas específicas de antígeno

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

La cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Desarrollo y validación de una sola molécula ultrasensible matriz Digital análisis de enzima-ligado del inmunosorbente para interferón-α humano

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...