우리는 유동세포계측법 장비 및 정렬 서비스를 제공하는 고속 셀 분류기 코어의 사용, 의학 세인트 루이스, MO에있는 반스 - 쥬이시 병원 워싱턴 대학 학교에서 앨빈 J. Siteman 암 센터를 주셔서 감사합니다. 이 작품은 보건 기금의 국립 연구소 R01 HL082549 및 K02 HL084179 (NRY)에 의해 지원되었다. Siteman 암 센터는 NCI 암 센터 지원 그랜트 P30 CA91842에 의해 부분적으로 지원됩니다.

1. 시약의 준비 <ol><li> FMS 관련 티로신 키나제 3 멸균 1000x 재고 솔루션 준비 (를 편명 - 3) 리간드, 대식 세포 / 과립구 콜로니 - 자극 인터루킨 (IL) -3 인자 (GM - CSF), 줄기 세포 인자 (SCF), thrombopoietin (TPO), 및 IL - 6 제조 업체의 지시에 따라. 무균 Retronectin 주식 솔루션 (1mg/ml)도 제조 업체의 지시에 따라 준비. 작은 aliquots하여 해당 주식 솔루션을 나누어 반복 동결 - 해동을 피하기 위해 -20 ° C에서 보관. </li><li> IMDM에 2% FBS를 준비합니다. </li><li> 최종 20% FBS의 농도, 2 MM의 글루타민, 100 단위 / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PS) 완벽한 IMDM 매체를 준비합니다. 바로 사용하기 전에 다음과 같은 크린 시토킨 추가 : 100 NG / ML 편명 - 3 리간드, 20 NG / ML GM - CSF, 100 NG / ML SCF, 100 NG / ML TPO, 50 NG / ML IL - 3, 100 NG / ML IL - 6. </li><li> HBSS의 1 % BSA (페놀 레드없이 칼슘 및 MG - 무료) 및 D - PBS (CA &amp; MG 무료)에서 2 % BSA를 준비합니다. 4 0.22 μm의 주사기 필터 및 매장 ° C. 통과하여 솔루션을 소독 </li><li> 4 HBSS와 저장소에 0.02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 준비 ° C. </li><li> -80에서 aliquots에 대한 관심과 저장소의 DNA ° C. 인코딩 GaLV - pseudotyped 레트로 바이러스 준비 이 절차는이 문서의 범위 밖이지만, (1-3) 다른 설명되어 있습니다. </li></ol> Giemsa의 스테 이닝을위한 <ol start="7"><li> 그냥 사용하기 전에 깨끗한 유리병에 1 μm의 여과지를 통해 두 번 라이트 / Giemsa 얼룩 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 지오다노 공식 - 즉시 사용하기 전에 필터링 라이트 / Giemsa 얼룩 솔루션과 인산염 버퍼 솔루션, 산도 6.4 200 ML 50 ML을 혼합하여 라이트 / Giemsa 버퍼 산도 6.4 준비합니다. </li><li> 3.5 LH 2 O.에서 KH 2 PO 27.3 g 4 나 2 HPO 4 4.62 g을 용해하여 인산 버퍼 용액, pH를 6.0 준비 </li><li> H 2 O.에서 50 %의 메탄올을 준비 </li></ol> 2. 절차 해동 및 CD34의 사전 활성화 + 세포 <ol><li> 37 신속하게 냉동 CD34 + 세포의 병을 해동 ° C 부드럽게 마지막 작은 얼음 결정이 남아 때까지 떨고 50 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액 (1 ML)를 송금. 부드럽게 실온 1 ML와 유리병에서 남아있는 세포를 씻어 2% FBS / IMDM하고 부드럽게 소용돌이 치는 동안 50 ML 튜브 드롭 현명한를 추가합니다. 3 분만 기다. 다음, 천천히 부드럽게 혼합하면서 2% FBS / IMDM 2 ML을 추가하고, 3 분 기다리십시오. 최종 볼륨 32 ML에 도달할 때까지, FBS / IMDM 그 3 분 간격으로 희석 세포 현탁액과 같은 볼륨 2 % 추가 추가 사이에 부드럽게 소용돌이에 의해 절차를 반복합니다. </li><li> 실온에서 10 분 250 XG에 원심 분리기와 0.5 주변 ML 뒤에 떠나는 뜨는을 제거합니다. </li><li> 20 ML 2퍼센트 FBS / IMDM에 정지하고 실온에서 팔분 200 XG에 centrifuging하여 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 뜨는을 제거하고 약 0.5 X 10 6 세포 / ML에서 전체 IMDM 매체에있는 세포를 일시 중지합니다. Trypan 파랑 솔루션의 같은 볼륨 (0.4 %)와 microtube, 혼합에 세포 현탁액의 10 μl를 타고 hemocytometer를 사용하여 계산합니다. </li><li> (1.3 참조) 크린 시토킨와 보충 전체 IMDM 미디어를 추가하여 0.1-0.15 X 10 6 세포 / ML로 세포를 희석 </li><li> 문화 2 일 5 % CO 2 humidified 37 ° C 배양기에서 세포. </li></ol> 바이러스 사전로드하여 Retroviral 전달 <ol start="7"><li> 형질 도입의 날, 준비하는 우물의 수를 결정하는 preloading 바이러스를 시작하기 전에 세포를 계산합니다. </li><li> 25 μg / ML에 Retronectin 재고 솔루션을 희석하고 24 잘되지 않은 대우 조직 문화 판의 각 잘 ~ 400 μl를 추가합니다. 사전 코팅으로 층류 흐름 biosafety 후드에 실온에서 2 시간 동안 부화. </li><li> Retronectin 솔루션을 제거하고 각 잘하는 D - PBS의 2 % BSA 400 μl를 추가합니다. 실온에서 30 분 알을 품다. </li><li> 바이러스 주식 솔루션을 녹여 얼음 계속. BSA 솔루션을 제거하기 위해 각 물론 바이러스 준비 0.5 ML를 추가하고 4 2200 XG에서 원심 분리기 ° C 15 분. </li><li> 우물에서 바이러스 솔루션을 제거하고 2.10보다 세 번에 설명되어있는 바이러스 로딩을 반복합니다. </li><li> 추운 0.5 ML HBSS (+ 칼슘 &amp; MG) 또는 IMDM 각 잘 린스. </li><li> 상온에서 팔분 200 XG에 centrifuging하여 미리 활성화 CD34 + 세포를 수집합니다. </li><li> 크린 시토킨 완벽한 IMDM 매체에서 1.5 ML 당 0.1-0.15 X 10 6 세포에서 세포를 Resuspend. </li><li> 각 물론 1.5 ML의 세포 현탁액을 추가하고 2 일간 5 % CO 2 humidified 37 ° C 배양기에서 알을 품다. </li></ol> 의 세포 분류와 컬렉션은 세포를 transduced <ol start="16"><li> 부드럽게하지만 철저하게 바이러스 로드된 판 위에있는 세포를 일시 중지원뿔 관에 50 μm의 CellTrics 전지 필터를 통해 S 및 필터. Trypan 파랑 솔루션의 동일한 볼륨 microtube, 혼합에 세포 현탁액의 10 μl를 타고 hemocytometer를 사용하여 계산합니다. 감기 0.02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) / HBSS (페놀 레드없이 칼슘 및 MG - 무료)의 0.8 ML 각 잘 씻어 50 μm의 CellTrics 전지 필터를 통해 동일한 수집 관에 추가할 수 있습니다. </li><li> 4 팔분 ° C 200 XG에서 세포를 원심 분리기, 4 8 분 200 XG에 centrifuging하여 추위 HBSS와 펠렛을 (페놀 레드없이 칼슘 및 MG - 무료) 씻어 ° C. </li><li> BSA / HBSS (페놀 레드 않고 칼슘 &amp; MG 무료) 15 X 10 6 / ML 또는 셀 정렬 0.250 ML 최소 볼륨의 농도 1 %의 펠렛을 Resuspend. 어둠 속에서 얼음 세포 보관하십시오. 감기 20% FBS / IMDM / 정렬 세포를 수집하기 위해 글루타민 / PS 매체를 포함하는 튜브를 준비합니다. 정렬은 MoFlo 고속 분류기을 (Dako, Glostrup, 덴마크)를 사용하여 의학의 워싱턴 대학 학교에서 앨빈 J. Siteman 암 센터의 고속 셀 분류기 코어에서 수행됩니다. </li></ol> CFC 분석 <ol start="19"><li> CFC 분석 미디어 3 ML aliquots의 필요한 번호를 녹여. 와동이 적극적으로 혼합 및 튜브 어떤 거품이 세포를 추가하기 전에 표면에 상승에 제출하도록 적어도 5 분 대기하도록. </li><li> 각 정렬 샘플에 대한 세포 농도를 얻으려면 대략적인 세포 현탁액 볼륨으로 정렬 시설에서 제공하는 휴대폰 번호를 나누었습니다. 3000을 가지고 바이러스 transduced, 차가운 2% FBS / IMDM을 포함하는 멸균 microtube에 정렬 세포. 사전 조정의 최종 정지 볼륨 약 0.3 ML됩니다 FBS / IMDM 그런데 2 %의 볼륨을. </li><li> , 세포를 일시 중지 및 2 MM L - 글루타민 1 % 메틸 셀룰로오스로 구성되어 있습니다 Methocult GF + H4435, 30 % FBS, 1 % BSA, 10 -4 M 2 - 메르 캅 토 에탄올의 3 ML의 나누어지는으로 전체 0.3 ML 세포 현탁액을 전송 50 NG / ML SCF, 20 NG / ML GM - CSF, 20 NG / ML IL - 3, 20, NG / ML IL - 6, 20 NG / ML G - CSF, 3 유닛 / IMDM에 ML erythropoietin. 1.3 %의 메틸 셀룰로오스 메틸 셀룰로오스로 구성되어 인간의 풍부한 미디어 (R &amp; D 시스템), 25 % FBS, 1 % BSA, 5 × 10 -5 M 2 - 메르 캅 토 에탄올, 2 MM L - 글루타민, 50 NG / ML SCF, 20 NG / GM - CSF ML, 20 NG / ML IL - 3, 20, NG / ML IL - 6, 20 NG / ML G - CSF, 3 유닛 / IMDM에 ML erythropoietin도 사용할 수 있습니다. </li><li> 와동이 적극적으로 혼합물이 완전히 상승하고 3-4 회를 떨어뜨릴 수 있습니다. 튜브 3 분 가만히 보자. </li><li> 3 ML의 주사기에 16 게이지 날이 엔드 바늘을 첨부하고 2.2 ML를 그립니다. 큰 거품을 그려하지 마십시오 몇 번 데이트를 추진하여 처음에 그들을 추방. 각각의 두 개의 30mm 비 취급 그릇에 1.1 ML를 밀어 넣기 및 회전에 의해 균일하게 혼합 분산. </li><li> 3 ML 멸균 물이 들어있는 물을 접시와 함께 100mm 접시에 접시를 중복 배치합니다. 17일 - 14 문화. </li><li> 점수 그리드로 표시된 문화 접시에있는 40x 배율에서 거꾸로 현미경으로 자신의 형태에 따라 식민지를 특징 및 점수. 순수 erythroid, myelomonocytic 및 혼합 : 우리의 분석의 목적은 식민지 3 범주로 구분됩니다. 더 콜로니 subclassification에 대한 제조 업체의 지시 사항을 참조하십시오. </li><li> 전체 CFC 분석 플레이트는 일반 600 DPI에서 스캐너, 그리고 식민지의 ph​​otomicrographs가 컬러 카메라가 장착된 거꾸로 현미경을 사용하는가 취해질 수 저전력을 (40x)를 사용하여 배율없이 검사할 수 있습니다. </li><li> 분화와 확산의 자세한 분석을 위해, 전체 CFC 분석 플레이트의 세포는 실내 온도 2퍼센트 FBS / IMDM 몇 권 정지하여 복구할 수 있습니다. 4 10 분 ° C 300 XG에서 원심 분리 후, 세포가 2% FBS / IMDM, 계산하고, 두 유동세포계측법에 대한 항체와 스테인드 또는 Giemsa의 얼룩을위한 Cytospin의 원심 분리기를 사용하여 슬라이드로 전송에 resuspended 있습니다. </li></ol> 항체 얼룩 및 유동세포계측법 <ol start="28"><li> 4 8 분 200 XG에 원심 분리기 세포 HBSS에 차가운 50% 정상 마우스 혈청에서 ° C와 resuspend (페놀 레드 않고 칼슘 &amp; MG 무료). </li><li> 관 당 80 μl (12 X 75mm 왕복 하단 튜브)에 약 5 × 10 5 세포를 놓고 얼음 계속. 항체 혼합물 (노 항체 컨트롤에 대한 약 20 μl 혼합 또는 부정적인 제어 솔루션)와 가볍게 튜브를 감청하여 믹스를 추가합니다. 없이 항체 또는 각 fluorochrome위한 안티 CD45 항체와 교정 제어 튜브를 준비합니다. 20 분 동안 어둡고 품어 얼음 속에서 플레이스 튜브. 가볍게 처음 10 분 후에 튜브를 도청하여 섞는다. 20 분 부화 후, 차가운 HBSS와 튜브를 작성하여 4 8 분 200 XG에 원심 분리기 ° C. 감기 0.5 % paraformaldehyde / HBSS에서 펠렛을 Resuspend. 항체의 혼합물은 일반적으로 다음과 같은 분석을 위해 사용됩니다. 골수양 차별 화를위한 : CD11b (phycoerythrin - 복합 클론 ICRF44) / CD33 (allophycocyanin - 복합 클론 WM53) / CD45 (phycoerythrin - Cy7 - congjugated 복제 HI30). erythroid 차별 경우 : CD71 (phycoerythrin - 복합 클론 M - A712) / CD235a (allophycocyanin - 복합 클론 GA - R2) / CD45 (phycoerythrin - Cy7 - congjugated 복제 HI30). </li><li> 유동세포계측법 5 색상 두 레이저 (BD Biosciences)로 업그레이 드 FACScan 흐름 cytometer에 의과 워싱턴 대학 학교에서 앨빈 J. Siteman 암 센터의 고속 셀 분류기 코어에서 수행하고 CellQuest (BD Biosciences) 또는를 사용하여 분석됩니다 FlowJO v7.2.4 (트리 스타 (주), 애쉬 랜드, OR, 미국) 소프트웨어. </li></ol> Giemsa의 얼룩 <ol start="31"><li> CFC 분석 플레이트에서 발견한 약 30,000 세포는 0.3에서 일시 중지 위에 설명한 ML 2퍼센트 FBS / IMDM하고 실온에서 10 분 1,000 RPM에서 Cytospin의 원심 분리기를 사용하여 슬라이드로 전학 왔어. </li><li> 다음과 같은 순서로 솔루션을 포함하는 구 얼룩 혈관을 설정합니다. <ol><li> 절대 메탄올 </li><li> 라이트 / Giemsa 재고 솔루션 </li><li> 라이트 / Giemsa 버퍼, pH를 6.4 </li><li> H 2 O의 50 % 메탄올 </li><li> H 2 O </li><li> H 2 O </li><li> 인산염 버퍼, 산도 6.0 </li><li> H 2 O </li><li> H 2 O </li></ol></li><li> 슬라이드 캐리어에 슬라이드를 삽입하고 (# 1) 절대 메탄올에서 수영 2 분 및 초과 메탄올을 얼룩. </li><li> 즉시, 5 분 라이트 / Giemsa 주식 솔루션에 슬라이드 캐리어 (# 2) 수영. </li><li> 라이트 / Giemsa 버퍼, pH를 6.4 (# 3)에 캐리어 전송 10 분 알을 품다. </li><li> (# 4) 50 % 메탄올에 두 항공사를 찍어, H 2 O (# 5), H 2 O (# 6)에서 다른 10 배, 10 배 그리고 인산 버퍼, pH를 6.0에서 5 시간 (# 7) . </li><li> H 2 O (# 8)에 캐리어를 전송 2 분 알을 품다. H 2 O (# 9)에 세척을 반복합니다. </li><li> 슬라이드는 캐리어에서 완전히 건조 공기를 허용합니다. 각 슬라이드를 제거하고 얼룩을 제거하기 위해 메탄올 - 절어 Kimwipes와 슬라이드의 뒷면을 닦아냅니다. Cytoseal 60 방울 날인에 덮개 유리를 놓습니다. </li><li> 500 세포 차동 개수는 올림푸스 BX51 현미경을 사용하여 각 Giemsa 묻은 슬라이드 수행됩니다. 셀 다섯 범주로 나누어집니다 : 원시 세포가 폭발하고 promyelocytes를 포함, 중간 골수양 세포가 myelocytes 및 metamyelocytes을 포함, 성숙한 골수양 세포는 밴드, 세그먼트 neutrophils, monocytes, 그리고 macrophages를 포함, 중간 erythroid 세포는 중간 hemoglobinization와 세포를 포함하며, 성숙 erythroid 세포는 다음과 같습니다 전체 hemoglobinization과 세포. Photomicrographs는 60x 기름 목적으로 올림 DP71 카메라로 찍은 있습니다. </li></ol> 3.0) 대표 결과 : <ol><li> CFC 분석 : 입력 셀 인구의 일부는, 분아 따위에 의해 번식 차별화, 그리고됩니다 14-17 일 잠복기 동안 반 고체 매체에 양식 ​​식민지. 본 실험에서는, 그것은 NUP98 - HOXA9 oncogene의 표현이 두드러진 빨간색 (erythroid 식민지) (그림 1) (3)의 형성을 일으킨 것이 분명하다. </li><li> 항체 스테 이닝 및 유동세포계측법 : CFC 분석 플레이트에서 수집한 세포의 흐름 cytometric immunophenotyping은 세포 인구의 분화 상태에 대한 정보를 제공합니다. 특정 분화 마커에 대한 항체의 결합 사용하여, 세포의 성숙의 혈통과 수준을 평가하실 수 있습니다. 이 경우에는 CD235a은 erythroid 세포를 식별하는 데 사용되었다. 그림 2A에 표시된 NUP98 - HOXA9는 CD235a + erythroid 세포의 비율 증가의 원인이 있지만, 이러한 세포 CD235a 표현의 밝기는 erythroid의 성숙의 억제를 나타내는, 컨트롤에 비해 감소했다. 그림 2B에서 골수양 세포들은 CD33 양성의 미덕에 의해 식별됩니다. NUP98 - HOXA9은 골수양 성숙 (3)의 억제와 일치하는 CD11b 표현의 밝기의 감소와 함께, CD33 + 세포의 숫자 감소가 발생했습니다. 그러므로 유동세포계측법 결과 NUP98 - HOXA9은 골수양 및 erythroid 모두 성숙의 억제와 erythroid 증식을 일으킨 것을 보여줍니다. </li><li> Giemsa의 스테 이닝 : CFC 분석 플레이트에서 수집한 세포의 형태학의 검사는 세포 인구의 성숙의 혈통과 학위에 대한 정보를 제공합니다. morphologically 얻은 결론은 흐름 cytometric 연구에 의해 얻은과는 다를 수 있으며, 따라서 이러한 방법 (3) 서로 보완하고 있습니다. 실험은 적어도 3 회 반복되며, 위에서 설명한 각각의 시간은 500 세포 차동 개수는 세포의 5 종류를 구별하기 위해 수행됩니다. 이러한 세포의 예는 그림 3에서 지적하고 있습니다. 결과는 사이에 통계적으로 의미있는 차이 oncogene - transduced 샘플과 제어가 있는지 확인하기 위해 tabulated 및 분석입니다. 이 경우 결과는 NUP98 - HOXA9는 숫자에 전반적인 증가를 일으킨 것으로 나타났다erythroid의 증식과 erythroid 및 골수양 성숙 (3) (표시되지 않음)을 모두 억제와 세포의. </li></ol> 그림 전설 <img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 : 인간의 CFC의 형태에 NUP98 - HOXA9의 효과. 기본 인간의 CD34 + 세포는 retrovirally 제어 MSCV - IRES - GFP 벡터 또는 벡터 중 하나가 NUP98 - HOXA9 표현과 transduced 있었고, 세포가 GFP의 양성을 위해 정렬했다. 한 천 세포 CFC 분석을위한 두 가지 중복 접시의 각에 씨앗을 품고 있었고, 실험 3 4 독립 번 반복되었다. 확대 (왼쪽)와 대표 erythroid 식민지 (오른쪽)의 낮은 전력 photomicrographs없이 대표 접시 (3) 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 : 유동세포계측법가 NUP98 - HOXA9에 의해 인간의 기본 CD34 + 세포 분화의 장애를 보여줍니다. (A) erythroid의 차별 화를위한 유동세포계측법 : CFC의 접시의 세포는 (그림 1 참조) CD45와 CD235a하는 항체와 수확 및 스테인드했다. CD235a는 + 게이트는 제어 세포에 비해 CD235a의 표현을 보여주는 히스토그램 (오른쪽 패널)에 역모를했습니다 (B) 골수양 차별 화를위한 유동세포계측법 : CFC 접시의 세포는 CD45과 CD33와 수확 및 스테인드했다. CD33는 + 게이트 (오른쪽 패널) 컨트롤에 비해 CD11b 표현을 보여주는 히스토그램을 꾸몄다되었습니다. 각 게이트 이내에 떨어지는 세포의 비율 (3) 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3 : 셀 형태가 NUP98 - HOXA9에 의해 분화의 방해가 벡터 제어에 비해 보여줍니다. Cytospin 얼룩은 CFC의 접시에서 준비하고 Giemsa 물들일되었습니다. Photomicrographs는 60x 오일 목적으로 대표 분야에서 찍은. B : 폭발, MM : 성숙 골수양, IM : 중간 골수양, ME : 성숙 erythroid, IE : 중급 erythroid (3).

<ol>
	<li>Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9+induces+long-term+proliferation+and+blocks+differentiation+of+primary+human+CD34++hematopoietic+cells.">NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells.</a> Cancer Res. , 66-6628 (2006).</li><li>Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+NUP98-DDX10+oncogene+on+primary+human+CD34++cells:+role+of+a+conserved+helicase+motif.">Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif.</a> Leukemia. , (2010).</li><li>Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+transformation+of+primary+human+hematopoietic+cells+by+the+oncogene+NUP98-HOXA9.">Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9.</a> PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).</li><li>Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hematopoietic+colonies+in+health+and+disease.">Human hematopoietic colonies in health and disease.</a> Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).</li><li>Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+colony-forming+cell+assays.">Hematopoietic colony-forming cell assays.</a> Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).</li><li>Coulombel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hematopoietic+stem/progenitor+cells:+strength+and+drawbacks+of+functional+assays.">Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays.</a> Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).</li><li>Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection,+maintenance,+and+differentiation+of+primitive+human+hematopoietic+cells+in+cultures+containing+murine+fibroblasts+engineered+to+produce+human+steel+factor,+interleukin-3,+and+granulocyte+colony-stimulating+factor.">Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor.</a> Blood. 88, 3765-3773 (1996).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

CFC의 분석은 조혈 progenitors의 확산과 차별의 패턴을 결정하고 oncogenes의 효과를 (4, 5) 연구에 광범위하게 사용되고 있습니다. 그것은 식민지가 단일 조상의 자손을 나타내는 개별적으로 추가 분석을 위해 제거할 수 있습니다 그러한 clonal 분석,되는 액체 문화 이상의 장점이 있습니다. 이러한 전지는 사용 감지 장기적인 문화 시작 셀 (LTC - IC) 분석 (6, 7). CFC 분석의 한계는 더 어려서 progenitors 또는 조...

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<td>IMDM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Technologies</td>
<td>12440</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>06150</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>L-Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Technologies</td>
<td>25030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin (PS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Technologies</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FLT-3 ligand</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>300-19</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GM-CSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>300-03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SCF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>300-07</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TPO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>300-18</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IL3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>200-03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IL6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>200-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma- Aldrich</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP118</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Retronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Takara Bio Inc</td>
<td>T100A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Technologies</td>
<td>14175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Technologies</td>
<td>14200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypan Blue solution (0.4%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8154</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methocult GF+ H4435</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>04445</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human Methylcellulose Enriched Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R &amp; D Systems</td>
<td>HSC005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wright/ Giemsa stain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harleco</td>
<td>64571</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 - Giordano formula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical Company</td>
<td>1450</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A412-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal 60</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>8310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Mouse Serum </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rockland Immunochemicals</td>
<td>D208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>555388</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>551378</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>557748</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>555537</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>551336</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>557748</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24-well non-treated tissue culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>35-1147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30 mm non-treated dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>27150 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 mm tissue culture dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-757-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gridded scoring dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>27500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 ml centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>35-2097</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>35-2070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringes 3 ml </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>28240</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>16 gauge blunt-end, 1&frac12; inch needle </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>28110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 &mu;m CellTrics cell filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Partec</td>
<td>04-004-2327</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hemocytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>0267110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TPX sample chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>A78710018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-550-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon filter cards</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>5991022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon cytospin slide holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>59920063</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon Complete Staining Assembly 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kimwipes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kimberly-Clark Corporation</td>
<td>34155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 &mu;m filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>28307-134</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inverted microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>Diaphot</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>DS-F11</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>BX51 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>DP71</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scanner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microtek</td>
<td>Scanmaker 4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vortex mixer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-812</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue culture incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sanyo</td>
<td>MCO-18AIC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytospin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon</td>
<td>Cytospin 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bench-top centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5810-R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water purification system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Barnstead</td>
<td>Nanopure-Diamond</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

colony forming cell (cfc) assay for human hematopoietic cells

인간 조혈 줄기 / 전구 세포는 보통 골수, 코드 혈액, 또는 주변 혈액에서 얻은 있으며, 조혈 및 leukemogenesis을 연구하는 데 사용됩니다. 그들은 림프 및 골수양 lineages로 차별화하는 능력이 있습니다. 셀 (CFC) 분석을 형성 식민지는 semisolid 매체 식민지를 형성하는 능력에 의해 증식 및 조혈 progenitors의 차별 패턴을 연구하는 데 사용됩니다. 입력 세포의 고정 숫자에 의해 형성된 콜로니의 숫자와 형태 차별 progenitors의 능력에 대한 사전 정보를 제공하고 세포 분열 따위에 의해 번식. 전지는 더욱 자신의 번호와 유동세포계측법 및 Giemsa 묻은 슬라이드 morphologic 평가를 사용하여 차별 상태를 평가하기 위해 각각의 식민지에서 또는 전체 접시에서 수확 수 있습니다. 이 분석은 골수양하지만 림프하지 차별을 평가하는 데 유용합니다. 이 맥락에서 용어 골수양는 granulocytic, monocytic erythroid 및 megakaryocytic lineages을 포괄하기 위해 넓은 의미에서 사용됩니다. 우리는 주변 혈액에서 파생 기본 인간의 CD34 + 세포의 분화에 oncogenes의 효과를 평가하기 위해이 분석을 사용했습니다. 이러한 목적 세포에 대한이 사건 NUP98 - HOXA9에서, 제어 retroviral 구조 또는 관심의 oncogene을 표현하는 구성 하나와 transduced 있습니다. 우리는 관심과 GFP 표지의 유전자를 생산하는 bicistronic mRNA를 표현 일반적으로 사용되는 retroviral 벡터, MSCV - IRES - GFP를 사용합니다. 세포 retroviral 전달하기 전에 이틀 동안 크린 시토킨의 면전에서 성장하여 미리 활성화됩니다. 또 이틀 뒤에는, GFP + 세포는 형광 활성화된 셀 정렬 (외과)에 의해 격리되며 크린 시토킨로 보충하고 식민지는 일반적으로 표면을 14 일에 나타날 때까지 incubated 메틸 셀룰로오스 함유 semisolid 매체와 혼합. 식민지의 개수와 형태가 설명되어 있습니다. 세포는 다음 접시에서 제거 씻어, 계산 및 유동세포계측법 및 morphologic 심사를 받게됩니다. 조혈 동안 표현 세포 표면 마커 특정 항체와 유동세포계측법는 가계와 성숙 단계에 대한 정보를 제공합니다. 라이트 - Giemsa의 얼룩 후 현미경으로 각각의 세포의 형태학의 연구는 혈통과 성숙에 관한 자세한 정보를 제공합니다. 세포의 비교 oncogene 조혈 차별에 oncogene의 효과를 밝혀와 transduced들에게 빈 벡터 제어와 transduced.

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Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

셀 (CFC) 분석을 형성 식민지는 조혈 progenitors은 세미 솔리드 매체 식민지를 형성하는에서 시험 관내 분석이다. 콜로니 형태, 세포 형태학 및 유동세포계측법의 조합은 다른 조혈 lineages 따라 분아 따위에 의해 번식하고 차별 progenitors의 능력을 평가하는 데 사용됩니다.

인간 조혈 세포 콜로니 형성 세포 (CFC) 어세이

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

colony-forming-cell-cfc-assay-for-human-hematopoietic-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

35.4K 조회수.  Washington University School of Medicine. 셀 (CFC) 분석을 형성 식민지는 조혈 progenitors은 세미 솔리드 매체 식민지를 형성하는에서 시험 관내 분석이다. 콜로니 형태, 세포 형태학 및 유동세포계측법의 조합은 다른 조혈 lineages 따라 분아 따위에 의해 번식하고 차별 progenitors의 능력을 평가하는 데 사용됩니다.

비디오: Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

연구

면역학 및 감염병학

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

에 셀 운명을 따라<em&gt; E. 대장균</em&gt; 파지 람다에 의해 감염 후

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

인간 Papillomavirus의 소설 T-세포 Epitopes를 특성화하기 위해 인터페론-γ 효소 연결된 Immunospot 분석의 이용

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

정제 된 조혈 줄기 / 전구 세포에 DNA 돌연변이를 확인

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

효율적인위한 킬러 인공 항원 제시 세포 (KaAPC)<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 항원 특이 T 세포의 고갈

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...