Wir danken der Alvin J. Siteman Cancer Center an der Washington University School of Medicine and Barnes-Jewish Hospital in St. Louis, MO, für den Einsatz der High Speed ​​Cell Sorter Core, die Durchflusszytometrie Geräte und Sortieren Dienstleistungen. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants R01 HL082549 und K02 HL084179 (NRY) unterstützt. Die Siteman Cancer Center ist zum Teil durch eine NCI Cancer Center Support Grant P30 CA91842 unterstützt.

1. VORBEREITUNG DER REAGENZIEN <ol><li> Bereiten Sie sterile 1000x Stammlösungen von FMS-bezogene Tyrosinkinase 3 (FLT-3)-Liganden, Granulozyten / Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), stem cell factor (SCF), Thrombopoietin (TPO), Interleukin (IL) -3 und IL-6 nach den Anweisungen des Herstellers. Bereiten Sie sterile Retronectin Stammlösung (1mg/ml) auch nach den Anweisungen des Herstellers. Teilen Sie diesen Stammlösungen in kleinen Portionen und halten bei -20 ° C bis wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden. </li><li> Bereiten Sie 2% FBS in IMDM. </li><li> Bereiten Sie komplette IMDM-Medium mit einer Endkonzentration von 20% FBS, 2 mM Glutamin, 100 Einheiten / ml Penicillin / Streptomycin (PS). Fügen Sie die folgenden Zytokine unmittelbar vor dem Gebrauch: 100 ng / ml FLT-3-Ligand, 20 ng / ml GM-CSF, 100 ng / ml SCF, 100 ng / ml TPO, 50 ng / ml IL-3, und 100 ng / ml IL-6. </li><li> Bereiten Sie 1% BSA in HBSS (Ca und Mg-frei, ohne Phenolrot) und 2% BSA in D-PBS (Ca und Mg-frei). Sterilisation der Lösungen, indem sie durch 0,22 um Spritzenfilter und lagern bei 4 ° C. </li><li> Bereiten 0,02% EDTA in HBSS und lagern bei 4 ° C. </li><li> Bereiten GaLV-pseudotypisiert Retrovirus Kodierung der DNA von Interesse und speichern in Aliquots bei -80 ° C. Dieses Verfahren ist nicht in den Anwendungsbereich dieses Artikels, ist aber an anderer Stelle (1-3) beschrieben. </li></ol> Für Giemsa Färbung <ol start="7"><li> Unmittelbar vor Gebrauch filtern die Wright / Giemsa-Lösung zweimal durch 1 um Filterpapier in eine saubere Glasflasche. </li><li> Unmittelbar vor dem Gebrauch vorbereiten Wright / Giemsa-Puffer pH 6,4, durch Mischen von 50 ml des gefilterten Wright / Giemsa-Lösung und 200 ml Phosphatpuffer, pH 6,4 - Giordano Formel. </li><li> Bereiten Phosphatpufferlösung, pH 6,0 durch Auflösen von 27,3 g KH 2 PO 4 und 4,62 g Na 2 HPO 4 in 3,5 LH 2 O. </li><li> Bereiten Sie 50% Methanol in H 2 O. </li></ol> 2. VERFAHREN Auftauen und vor Aktivierung der CD34 +-Zellen <ol><li> Tauwetter ein Fläschchen eingefroren CD34 +-Zellen schnell bei 37 ° C durch leichtes Schütteln, bis eine letzte kleine Eiskristall ist links und Transfer der Zellsuspension (1 ml) zu einem 50 ml konischen Rohr. Vorsichtig abspülen die restlichen Zellen aus dem Fläschchen mit 1 ml Raumtemperatur 2% FBS / IMDM und fügen Sie sie der 50 ml Tube tropfenweise während vorsichtiges Schwenken. Warten Sie 3 Minuten. Anschließend langsam 2 ml 2% FBS / IMDM, während vorsichtiges Mischen und warten für 3 Minuten. Wiederholen Sie den Vorgang durch Zugabe von 2% FBS / IMDM, dass ist das gleiche Volumen wie die verdünnte Zellsuspension bei 3 min Intervallen, vorsichtiges Schwenken in zwischen den Zugaben, bis das Endvolumen erreicht 32 ml. </li><li> Zentrifuge bei 250 xg für 10 Minuten bei Raumtemperatur und Entfernen des Überstandes und hinterließ rund 0,5 ml. </li><li> Waschen des Pellets durch Suspendierung in 20 ml 2% FBS / IMDM und Zentrifugieren bei 200 xg für 8 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und die Zellen in komplette IMDM Medium bei ca. 0,5 x 10 6 Zellen / ml. Nehmen Sie sich 10 ul der Zellsuspension in ein Mikroröhrchen, vermischen sich mit dem gleichen Volumen Trypanblau-Lösung (0,4%) und zählt mit einer Zählkammer. </li><li> Verdünnen Sie die Zellen, um 0,1-0,15 x 10 6 Zellen / ml durch Zugabe von kompletten IMDM-Medium mit Zytokinen ergänzt (siehe 1.3) </li><li> Kultur der Zellen in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 für 2 Tage. </li></ol> Retrovirale Transduktion durch Viren pre-loading <ol start="7"><li> Am Tag der Transduktion, zählen Zellen vor dem Start Virus Vorbelastung auf die Anzahl der Brunnen, um vorbereitet zu bestimmen. </li><li> Verdünnen Sie die Retronectin Stammlösung auf 25 ug / ml, und fügen Sie 400 ul in jede Vertiefung einer 24-well nicht behandelten Gewebekulturplatte. Inkubieren für 2 Stunden bei Raumtemperatur in der Laminar-Flow-Biosicherheit Haube Vorstrich. </li><li> Entfernen Sie die Retronectin Lösung und fügen 400 ul von 2% BSA in D-PBS in jede Vertiefung. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Thaw Virus-Stammlösungen und halten auf dem Eis. Entfernen Sie die BSA-Lösung, 0,5 ml Virus-Präparation in jede Vertiefung und Zentrifuge bei 2200 xg bei 4 ° C für 15 Minuten. </li><li> Entfernen Sie den Virus-Lösung von Brunnen und wiederholen Sie den Virus loading in 2.10 noch dreimal beschrieben. </li><li> Spülen Sie jede Vertiefung mit kaltem 0,5 ml HBSS (+ Ca und Mg) oder IMDM. </li><li> Sammeln Sie die pre-activated CD34 +-Zellen durch Zentrifugation bei 200 xg für 8 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Resuspendieren der Zellen bei 0,1-0,15 x 10 6 Zellen pro 1,5 ml in komplettem IMDM-Medium mit Zytokinen. </li><li> 1,5 ml Zellsuspension in jede Vertiefung und inkubieren in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 für 2 Tage. </li></ol> Zellsortierung und Sammlung von transduzierten Zellen <ol start="16"><li> Behutsam, aber gründlich die Zellen in den obigen Virus-geladenen Plattes und durch ein 50 um CellTrics Zelle Filter in einem konischen Rohr. Nehmen Sie sich 10 ul der Zellsuspension in ein Mikroröhrchen, vermischen sich mit dem gleichen Volumen Trypanblau-Lösung und rechnen mit einer Zählkammer. Spülen Sie jede Kavität mit 0,8 ml kalter 0,02% EDTA / HBSS (Ca und Mg-frei ohne Phenolrot) und fügen Sie die gleiche Sammlung Schlauch durch eine 50 um CellTrics Zelle filtern. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 xg für 8 Minuten bei 4 ° C, und waschen Sie das Pellet mit kaltem HBSS (Ca und Mg-frei ohne Phenolrot) durch Zentrifugation bei 200 xg für 8 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Das Pellet in 1% BSA / HBSS (Ca und Mg-frei ohne Phenolrot) zu einer Konzentration von 15 X 10 6 / ml oder ein minimales Volumen von 0,250 ml für die Zell-Sortierung. Halten Sie die Zellen auf Eis im Dunkeln. Bereiten Sie ein Röhrchen mit kaltem 20% FBS / IMDM / Glutamin / PS Medium zum Sammeln der sortierten Zellen. Die Sortierung erfolgt auf der High Speed ​​Cell Sorter Kern des Alvin J. Siteman Cancer Center an der Washington University School of Medicine mit einem MoFlo High-Speed-Sorter (Dako, Glostrup, Dänemark) durchgeführt. </li></ol> CFC-Assay <ol start="19"><li> Thaw die erforderliche Anzahl von 3 ml Aliquots von CFC-Assay Medien. Vortex kräftig zu mischen und die Röhrchen stehen mindestens 5 min zu lassen alle Blasen an die Oberfläche, bevor Sie Zellen steigen. </li><li> Um die Zellkonzentration für jede sortierte Stichprobe, teilen sich die Zellzahl durch die Sortieranlage von der ungefähren Zellsuspension Volumen zur Verfügung gestellt. Nehmen Sie 3.000 Virus-transduzierten, sortierten Zellen in eine sterile Mikroröhrchen mit kalten 2% FBS / IMDM. Pre-Einstellen der Lautstärke von 2% FBS / IMDM, so dass die endgültige Suspension Volumen wird ca. 0,3 ml werden. </li><li> Suspend den Zellen und den Transfer der gesamten 0,3 ml Zellsuspension auf eine 3 ml Aliquot Methocult GF + H4435, die von 1% Methylcellulose besteht, 30% FBS, 1% BSA, 10 -4 M 2-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin, 50 ng / ml SCF, 20 ng / ml GM-CSF, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6, 20 ng / ml G-CSF, und 3 Einheiten / ml Erythropoietin in IMDM. Menschliche Methylcellulose Enriched Media (R &amp; D Systems), die von 1,3% Methylcellulose besteht, 25% FBS, 1% BSA, 5 x 10 -5 M 2-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin, 50 ng / ml SCF, 20 ng / ml GM-CSF, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6, 20 ng / ml G-CSF, und 3 Einheiten / ml Erythropoietin in IMDM können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Vortex kräftig, um das Gemisch vollständig Aufstieg und Fall 3-4 mal. Lassen Sie den Schlauch stehen noch für 3 min. </li><li> Bringen Sie einen 16-Gauge-blunt-end Nadel ein 3 ml Spritze und ziehen Sie 2,2 ml. Zeichnen Sie nicht bis große Blasen, vertreiben sie an den Anfang, indem Sie ein paar mal. Schieben Sie 1,1 ml jeweils in zwei 30 mm nicht behandelten Schale und breitete die Mischung gleichmäßig durch Drehen. </li><li> Legen Sie doppelte Platten in einem 100 mm-Platte zusammen mit einer Schüssel Wasser mit 3 ml sterilem Wasser. Kultur für 14 bis 17 Tagen. </li><li> Charakterisieren und Gäste den Kolonien nach ihrer Morphologie mit einem inversen Mikroskop bei 40facher Vergrößerung in einer Kulturschale mit einem Scoring-Gitter markiert. Pure erythroiden, myelomonozytäre und gemischt: Für die Zwecke unserer Test werden die Kolonien in 3 Kategorien eingeteilt. Siehe Anweisungen des Herstellers für weitere Kolonie Subklassifikation. </li><li> Die gesamte FCKW-Assay Platte kann ohne Vergrößerung mit einem normalen Scanner bei 600 dpi, und Low-Power-(40x) Aufnahmen von Kolonien aufgenommen mit einem inversen Mikroskop mit einer Farbkamera ausgestattet werden können gescannt werden. </li><li> Zur weiteren Analyse der Differenzierung und Proliferation, werden die Zellen aus dem gesamten CFC Assay-Platte durch die Aussetzung in mehreren Bänden der Raumtemperatur 2% FBS / IMDM erholt. Nach Zentrifugation bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C werden die Zellen in 2% FBS / IMDM, gezählt und entweder mit Antikörpern für die Durchflusszytometrie gebeizt oder an Folien mit einem Cytospin Zentrifuge für Giemsafärbung resuspendiert. </li></ol> Antikörper-Färbung und Durchflusszytometrie <ol start="28"><li> Centrifuge Zellen bei 200 xg für 8 min bei 4 ° C und resuspendieren in kaltem 50% normal Mausserum in HBSS (Ca und Mg-frei ohne Phenolrot). </li><li> Es werden ca. 5 x 10 5 Zellen in 80 ul pro Röhrchen (12 x 75 mm Rundboden-Röhrchen) und halten Sie auf dem Eis. Add-Antikörper-Gemisch (ca. 20 ul Gemisch oder negativen Kontroll-Lösung für nicht-Antikörper-Kontrollen) zugeben und durch leichtes Klopfen der Rohre. Bereiten Kalibrierung Röhren ohne Antikörper oder mit einem anti-CD45 Antikörper für jedes Fluorochrom. Die Röhrchen auf Eis im Dunkeln inkubieren für 20 Minuten. Mix durch leichtes Klopfen Rohre nach den ersten 10 min. Nach der 20 min Inkubation, füllen Sie das Röhrchen mit kaltem HBSS und Zentrifuge bei 200 xg für 8 min bei 4 ° C. Das Pellet in kaltem 0,5% Paraformaldehyd / HBSS. Die folgenden Mischungen von Antikörpern sind in der Regel für unsere Analyse verwendet. Für myeloische Differenzierung: CD11b (Phycoerythrin-konjugierten Klon ICRF44) / CD33 (allophycocyanin-konjugierte Klon WM53) / CD45 (Phycoerythrin-Cy7-congjugated Klon HI30). Für erythroiden Differenzierung: CD71 (Phycoerythrin-konjugierten Klon M-A712) / CD235a (Allophycocyanin-konjugierte Klon GA-R2) / CD45 (Phycoerythrin-Cy7-congjugated Klon HI30). </li><li> Die Durchflusszytometrie ist an der High Speed ​​Cell Sorter Kern des Alvin J. Siteman Cancer Center an der Washington University School of Medicine an einem FACScan Durchflußzytometer aufgerüstet zu 5 Farben und zwei Lasern (BD Biosciences) durchgeführt und ausgewertet werden CellQuest (BD Biosciences) oder FlowJO v7.2.4 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA) Software. </li></ol> Giemsa-Färbung <ol start="31"><li> Rund 30.000 Zellen aus FCKW-Assay-Platten wieder oben beschrieben sind in 0,3 suspendiert ml 2% FBS / IMDM und auf einem Objektträger mit einem Cytospin Zentrifuge bei 1.000 rpm für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Set-up neun Färbung Gefäße mit Lösungen in der folgenden Reihenfolge. <ol><li> Absolute Methanol </li><li> Wright / Giemsa-Stammlösung </li><li> Wright / Giemsa-Puffer, pH 6,4 </li><li> 50% Methanol in H 2 O </li><li> H 2 O </li><li> H 2 O </li><li> Phosphatpuffer, pH 6,0 </li><li> H 2 O </li><li> H 2 O </li></ol></li><li> Legen Sie die Folien in eine Folie Träger und tauchen in absolutem Methanol (# 1) für 2 min und abtupfen überschüssige Methanol. </li><li> Sofort tauchen die Spannplatte in Wright / Giemsa-Stammlösung (# 2) für 5 min. </li><li> Übertragen Sie die Träger in Wright / Giemsa-Puffer, pH 6,4 (# 3) und Inkubation für 10 min. </li><li> Tauchen Sie den Träger zweimal in 50% Methanol (# 4), 10-mal in H 2 O (# 5), weitere 10 Mal in H 2 O (# 6) und dann 5 Mal in Phosphatpuffer, pH 6.0 (# 7) . </li><li> Übertragen Sie die Träger in H 2 O (# 8) und Inkubation für 2 min. Wiederholen Sie die Wäsche in H 2 O (# 9). </li><li> Lassen Sie die Folien an der Luft trocknen vollständig in den Träger. Entfernen Sie jede Folie und wischen Sie die Rückseite der Folie mit Methanol getränkten Kimwipes um Flecken zu entfernen. Geben Sie einen Tropfen Cytoseal 60 und einem Deckglas zu versiegeln. </li><li> Ein 500-Zelle Differentialblutbild ist für jeden Giemsa-gefärbten Folie mit einer Olympus BX51 Mikroskop durchgeführt. Die Zellen werden in fünf Kategorien unterteilt: primitive Zellen sind Blasten und Promyelozyten; Zwischen-myeloischen Zellen gehören Myelozyten und Metamyelozyten; reifen myeloischen Zellen gehören Bänder, segmentierten neutrophilen Granulozyten, Monozyten und Makrophagen, Zwischen-erythroiden Zellen sind Zellen mit mittleren hemoglobinization und reifen erythroiden Zellen sind Zellen mit voller hemoglobinization. Mikroaufnahmen sind mit einer Olympus DP71-Kamera mit 60x Öl-Objektiv aufgenommen. </li></ol> 3,0) repräsentative Ergebnisse: <ol><li> CFC-Assay: Einige der Input-Zell-Population wird zunehmen, zu differenzieren und bilden Kolonien auf dem halbfesten Medium während der 14 bis 17-tägigen Inkubationszeit. In diesem Experiment ist es offensichtlich, dass die Expression des NUP98-HOXA9 Onkogen die Bildung von markanten roten (erythroiden Kolonien) (Abbildung 1) (3) verursacht. </li><li> Antikörper-Färbung und Durchflusszytometrie: Flow Immunphänotypisierung von Zellen aus FCKW-Assay-Platten gesammelt liefert Informationen über die Differenzierung Stand der Zellpopulation. Durch die kombinierte Verwendung von Antikörpern gegen bestimmte Differenzierungsmarker, kann die Linie und den Grad der Reifung von Zellen beurteilt werden. In diesem Fall CD235a wurde verwendet, um erythroiden Zellen zu identifizieren. Wie in Abbildung 2A gezeigt, verursacht NUP98-HOXA9 eine Zunahme des Anteils der CD235a + erythroiden Zellen, aber die Helligkeit des CD235a Ausdruck von diesen Zellen war im Vergleich zur Kontrollgruppe vermindert, was darauf hinweist Hemmung der erythroiden Reifung. In Abbildung 2B sind myeloischen Zellen durch ihre CD33-Positivität identifiziert. NUP98-HOXA9 verursacht eine Abnahme der Zahl der CD33 +-Zellen, mit einer Abnahme der Helligkeit von CD11b Expression, im Einklang mit Hemmung der myeloischen Reifung (3). So ist die Durchflusszytometrie Ergebnisse zeigen, dass NUP98-HOXA9 einer Erythroid Hyperplasie mit der Hemmung der beiden myeloischen und erythroiden Reifung verursacht. </li><li> Giemsa-Färbung: Morphologische Untersuchung von Zellen aus FCKW-Assay-Platten gesammelt gibt Auskunft über die Herkunft und Reifegrad der Zellpopulation. Die Schlussfolgerungen erhalten morphologisch können von den durch durchflusszytometrische Studien gewonnenen unterscheiden und damit diese Methoden sind komplementär zueinander (3). Das Experiment ist mindestens 3 mal wiederholt, und jedes Mal, wenn ein 500-Zelle Differentialblutbild durchgeführt wird, um 5 Kategorien von Zellen zu unterscheiden, wie oben beschrieben. Beispiele für diese Zellen sind in Abbildung 3 hingewiesen. Die Ergebnisse sind tabellarisch dargestellt und analysiert, um festzustellen, ob es statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Onkogen-transduzierten Probe und der Kontrolle. In diesem Fall zeigten die Ergebnisse, dass NUP98-HOXA9 eine allgemeine Erhöhung der Anzahl verursachts von Zellen, mit erythroiden Hyperplasie und Hemmung der beiden roten und weißen Reifen (3) (nicht dargestellt). </li></ol> ABBILDUNG LEGENDS <img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Die Auswirkungen der NUP98-HOXA9 auf die menschliche CFC Morphologie. Primäre humane CD34 +-Zellen wurden retroviral transduzierten entweder mit Kontrolle MSCV-IRES-GFP-Vektor oder Vektor, NUP98-HOXA9, und die Zellen wurden GFP-Positivität sortiert. Tausend Zellen wurden in jeweils zwei doppelte Platten für CFC-Assay ausgesät und der Versuch wurde 3 4 unabhängige mal wiederholt. Vertreter Platten ohne Vergrößerung (links) und Low-Power-Aufnahmen von repräsentativen erythroiden Kolonien (rechts) gezeigt werden (3). <img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: Die Durchflusszytometrie zeigt Störung des primären humanen CD34 +-Zell-Differenzierung durch NUP98-HOXA9. (A) Durchflusszytometrie für erythroiden Differenzierung: Zellen aus dem CFC-Platten (siehe Abbildung 1) wurden geerntet und mit Antikörpern angefärbt, um CD45 und CD235a. Die CD235a + Tor wurde in einem Histogramm (rechts) aufgetragen, um die Expression von CD235a relativ zu Kontrollzellen zeigen (B) Durchflusszytometrie für myeloische Differenzierung: Zellen aus dem CFC-Platten wurden geerntet und mit CD45 und CD33 gefärbt. Die CD33 + Tor wurde in einem Histogramm aufgetragen, um CD11b Expression im Vergleich zur Kontrollgruppe (rechts) zeigen. Der prozentuale Anteil der Zellen fallen jedes Tor werden angezeigt (3). <img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3: Zellmorphologie zeigt Störung der Differenzierung von NUP98-HOXA9 zu-Vektor-Regelung verglichen. Cytospin Abstriche wurden von CFC-Platten hergestellt und mit Giemsa. Mikroaufnahmen wurden aus repräsentativen Bereichen mit einem 60x Öl-Objektiv aufgenommen. B: blast; MM: reifen myeloischen, IM: Zwischen myeloische, ME: mature erythroiden, IE: Zwischen erythroiden (3).

<ol>
	<li>Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9+induces+long-term+proliferation+and+blocks+differentiation+of+primary+human+CD34++hematopoietic+cells.">NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells.</a> Cancer Res. , 66-6628 (2006).</li><li>Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+NUP98-DDX10+oncogene+on+primary+human+CD34++cells:+role+of+a+conserved+helicase+motif.">Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif.</a> Leukemia. , (2010).</li><li>Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+transformation+of+primary+human+hematopoietic+cells+by+the+oncogene+NUP98-HOXA9.">Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9.</a> PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).</li><li>Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hematopoietic+colonies+in+health+and+disease.">Human hematopoietic colonies in health and disease.</a> Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).</li><li>Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+colony-forming+cell+assays.">Hematopoietic colony-forming cell assays.</a> Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).</li><li>Coulombel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hematopoietic+stem/progenitor+cells:+strength+and+drawbacks+of+functional+assays.">Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays.</a> Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).</li><li>Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection,+maintenance,+and+differentiation+of+primitive+human+hematopoietic+cells+in+cultures+containing+murine+fibroblasts+engineered+to+produce+human+steel+factor,+interleukin-3,+and+granulocyte+colony-stimulating+factor.">Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor.</a> Blood. 88, 3765-3773 (1996).</li></ol>

Der CFC-Assay wurde intensiv auf die Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen Muster zu ermitteln und die Auswirkungen der Onkogene (4, 5) Studie verwendet. Es hat den Vorteil gegenüber flüssigen Kulturen zu einer klonalen Assay, so dass die Kolonien die Nachkommen eines einzigen Stammvater vertreten und können individuell für die weitere Analyse entfernt werden. Die Begrenzung der FCKW-Test ist, dass es nicht für den Nachweis von mehr unreife Vorläuferzellen oder hämatopoetische S...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>IMDM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Technologies</td>
<td>12440</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>06150</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Technologies</td>
<td>25030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin (PS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Technologies</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FLT-3 ligand</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>300-19</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GM-CSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>300-03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SCF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>300-07</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TPO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>300-18</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IL3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>200-03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IL6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>200-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma- Aldrich</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP118</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Retronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Takara Bio Inc</td>
<td>T100A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Technologies</td>
<td>14175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Technologies</td>
<td>14200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypan Blue solution (0.4%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8154</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methocult GF+ H4435</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>04445</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human Methylcellulose Enriched Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R &amp; D Systems</td>
<td>HSC005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wright/ Giemsa stain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harleco</td>
<td>64571</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 - Giordano formula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical Company</td>
<td>1450</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A412-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal 60</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>8310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Mouse Serum </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rockland Immunochemicals</td>
<td>D208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>555388</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>551378</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>557748</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>555537</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>551336</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>557748</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24-well non-treated tissue culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>35-1147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30 mm non-treated dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>27150 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 mm tissue culture dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-757-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gridded scoring dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>27500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 ml centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>35-2097</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>35-2070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringes 3 ml </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>28240</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>16 gauge blunt-end, 1&frac12; inch needle </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>28110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 &mu;m CellTrics cell filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Partec</td>
<td>04-004-2327</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hemocytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>0267110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TPX sample chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>A78710018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-550-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon filter cards</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>5991022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon cytospin slide holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>59920063</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon Complete Staining Assembly 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kimwipes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kimberly-Clark Corporation</td>
<td>34155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 &mu;m filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>28307-134</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inverted microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>Diaphot</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>DS-F11</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>BX51 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>DP71</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scanner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microtek</td>
<td>Scanmaker 4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vortex mixer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-812</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue culture incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sanyo</td>
<td>MCO-18AIC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytospin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon</td>
<td>Cytospin 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bench-top centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5810-R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water purification system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Barnstead</td>
<td>Nanopure-Diamond</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

colony forming cell (cfc) assay for human hematopoietic cells

Humanen hämatopoetischen Stammzellen / Vorläuferzellen sind in der Regel aus Knochenmark, Nabelschnurblut oder dem peripheren Blut gewonnen und genutzt werden, um die Blutbildung und Leukämogenese studieren. Sie haben die Fähigkeit, sich in lymphoiden und myeloischen Linien zu differenzieren. Die Kolonie-bildenden Zellen (CFC)-Assay wird verwendet, um die Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen Muster durch ihre Fähigkeit, Kolonien in einem halbfesten Medium Form zu studieren. Die Anzahl und die Morphologie der Kolonien, die durch eine feste Anzahl von Input-Zellen gebildet vorläufige Angaben über die Fähigkeit der Vorläuferzellen zu differenzieren und zu vermehren. Die Zellen können aus einzelnen Kolonien oder die ganze Platte geerntet werden, um weiter zu prüfen ihre Zahl und Differenzierung Staaten mittels Durchflusszytometrie und morphologische Beurteilung der Giemsa-gefärbten Objektträgern. Dieser Test ist nützlich für die Beurteilung der myeloischen aber nicht lymphoide Differenzierung. Der Begriff myeloischer in diesem Zusammenhang ist im weiteren Sinne verwendet, um granulozytäre, Monozyten, erythroiden und Megakaryozyten Linien umfassen. Wir haben diesen Test verwendet werden, um die Auswirkungen der Onkogene auf die Differenzierung von primären humanen CD34 +-Zellen aus dem peripheren Blut gewonnen zu beurteilen. Zu diesem Zweck Zellen sind entweder mit Kontrolle retroviralen Konstrukt oder ein Konstrukt Expression des Onkogens von Interesse transduziert, in diesem Fall NUP98-HOXA9. Wir beschäftigen eine häufig verwendete retrovirale Vektor, MSCV-IRES-GFP, dass eine bicistronische mRNA, die das Gen von Interesse und ein GFP-Marker produziert ausdrückt. Die Zellen werden durch die in Gegenwart von Zytokinen für zwei Tage vor der retroviralen Transduktion voraktiviert. Nach zwei weiteren Tagen werden GFP +-Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) isoliert und mit einer Methylcellulose-haltigen halbfesten Medium mit Zytokinen ergänzt und inkubiert, bis Kolonien auf der Oberfläche, in der Regel 14 Tage angezeigt werden. Die Anzahl und Morphologie der Kolonien sind dokumentiert. Die Zellen werden dann von den Platten entfernt, gewaschen, gezählt und einer Durchflusszytometrie und morphologische Untersuchung. Durchflusszytometrie mit spezifischen Antikörpern an die Zelloberfläche Marker während der Hämatopoese ausgedrückt gibt Auskunft über Herkunft und Reifung der Bühne. Morphologische Untersuchungen von einzelnen Zellen unter dem Mikroskop nach Wright-Giemsa-Färbung liefern weitere Informationen in Bezug auf Herkunft und Reifung. Vergleich von Zellen transduziert mit Kontrolle leeren Vektor zu den transduzierten mit einem Onkogen zeigt die Auswirkungen des Onkogens auf hämatopoetischen Differenzierung.

Watch this Scientific Journal Video about Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells at JoVE.com

Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

Die Kolonie-bildenden Zellen (CFC)-Assay ist ein in vitro Assay, bei dem hämatopoetischen Vorläuferzellen bilden Kolonien in einem halbfesten Medium. Eine Kombination aus Koloniemorphologie, Zellmorphologie und Durchflusszytometrie werden verwendet, um die Fähigkeit der Vorläuferzellen zur Proliferation und Differenzierung entlang der verschiedenen hämatopoetischen Linien zu beurteilen.

Colony Forming Cell (CFC)-Assay für humanen hämatopoetischen Zellen

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

colony-forming-cell-cfc-assay-for-human-hematopoietic-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

35.5K Aufrufe.  Washington University School of Medicine. Die Kolonie-bildenden Zellen (CFC)-Assay ist ein in vitro Assay, bei dem hämatopoetischen Vorläuferzellen bilden Kolonien in einem halbfesten Medium. Eine Kombination aus Koloniemorphologie, Zellmorphologie und Durchflusszytometrie werden verwendet, um die Fähigkeit der Vorläuferzellen zur Proliferation und Differenzierung entlang der verschiedenen hämatopoetischen Linien zu beurteilen.

Serie: Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

Verwendung von Interferon-γ enzyme-linked immunospot Assay zur Novel T-Zell-Epitope des humanen Papillomvirus Charakterisieren

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

Identifizierung von DNA-Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen Gereinigtes / Vorläuferzellen

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Killer Künstliche Antigen-präsentierenden Zellen (KaAPC) für effiziente<em&gt; In-vitro-</em&gt; Depletion von humanen Antigen-spezifischen T-Zellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Methods Article

Colony Forming Cell (CFC)-Assay für humanen hämatopoetischen Zellen