La reposo del ciclo celular es una característica clave de las células madre hematopoyéticas. Este protocolo ayuda a entender el comportamiento de los HSC humanos en reposo in vitro en condiciones fisiológicas cercanas. Utilizando este protocolo, los investigadores pueden probar el efecto de varios compuestos, nutrientes o proteínas que regulan el estado del ciclo celular, así como la diferenciación de los HSC de una manera escalable sin utilizar modelos animales.
Los medicamentos contra el cáncer tienen efectos variables en la supervivencia de los HSC en reposo y los progenitores del ciclismo. Este protocolo permite encontrar agentes que perdonen los HSC o agentes que dañan selectivamente las células madre leucémicas quiescentes. Demostrando que el procedimiento será Hiroshi Kobayashi, un investigador senior del Laboratorio Takubo.
Para empezar, disolver 16 miligramos por mililitro de palmitato sódico, 30 miligramos por mililitro de oleato de sodio y cuatro miligramos por colesterol mililitro en metanol en tubos de vidrio. Almacene las soluciones lipídicas a 30 grados centígrados negativos y descongelarlas antes de usarlas. En un tubo de vidrio fresco, mezcle las soluciones lipídicas para obtener la concentración final de 100 microgramos por mililitro de palmitato, 100 microgramos por oleato de mililitro y 20 microgramos por colesterol mililitro.
Evaporar el metanol pasando gas nitrógeno a través de la solución lipídica. Evapore completamente el metanol restante calentando el tubo de vidrio en un baño de agua a 37 grados Centígrados. Preparar dmem / F-12 medio con HEPES y glutamina.
Agregue sulfato de penicilina y estreptomicina para una concentración final de 50 unidades y 50 microgramos por mililitro respectivamente. El medio se puede almacenar a cuatro grados centígrados durante al menos dos meses. Añadir 4% de BSA a DMEM / F-12 medio con HEPES y glutamina, a continuación, ajustar el pH del medio a 7.6 utilizando solución de hidróxido de sodio.
Agregue el medio al tubo de vidrio con los lípidos. Disolver completamente los lípidos por sonicación. Si el medio es opaco después de la sonicación, amplíe el tiempo de sonicación.
Cuando se disuelven la BSA y los lípidos, las muestras deben almacenarse a 80 grados centígrados negativos y utilizarse en un plazo de dos meses. Agregue 0,001X de insulina, transferrina, selenita sódica y mezcla de amina de etanol al DMEM/F-12 y luego filtre el medio mixto usando un filtro de 0,22 micrómetros. Antes de su uso, agregue el factor de células madre humanas o SCF y trombopoietina humana o TPO a los medios de cultivo a una concentración final de tres nanogramos por mililitro cada uno.
Transfiera 200 microlitros de los medios de cultivo preparados previamente con citoquinas a placas planas de 96 pozos. Para evitar la evaporación del medio, llene todos los pozos no utilizados con 100 a 200 microlitros de PBS. Resuspend las células madre hematopoyéticas ordenadas o HSC en medios de cultivo sin citoquinas a 60 células por microlitro.
Aliquot 600 células en cada pozo. Menos de 300 células conducirán a una mayor variación técnica y la culturización de más de 1.000 células en un solo pozo debe evitarse debido a la privación de nutrientes o acumulación de citoquinas o quimioquinas desfavorables. Culta las células de una incubadora de múltiples gases humidificada a 37 grados centígrados en una atmósfera de dióxido de carbono del 5% y 1% de oxígeno.
Después de siete días de culturizar los HSC purificados, hasta el 80% de las células mostraron el marcador CD34 positivo y los fenotipos negativos CD38. El número total de células dependía de la concentración de citoquinas. Mayores concentraciones de SCF y TPO indujeron la entrada en el ciclo celular, proliferación y diferenciación.
El número de HSC fenotípicos caracterizados por el marcador CD34 positivo, CD38 negativo, CD90 positivos y CD45 RA fenotipos negativos aumentó en proporción a las concentraciones de SCF o TPO, mientras que la frecuencia entre las células totales disminuyó. Después de tres meses de trasplante de HSC de médula ósea adulta cultivada, la reconstitución puede evaluarse en función de su frecuencia en la sangre periférica de la murina positiva CD45 humana, células negativas ter119 negativas CD45. Tres linajes, incluyendo células B positivas CD19, CD13 negativos, células mieloides positivas CD33 y células T positivas CD3 fueron reconstituidas en ratones NOG trasplantados con HSC recién descongelados o cultivados.
Tras el cultivo, los HSC pueden someterse a perfiles de expresión génica, como la secuenciación de PCR y ARN en tiempo real. También se puede realizar una validación funcional mediante el trasplante en ratones inmunodeficientes. Los investigadores pueden comparar directamente el ciclismo y los HSC en reposo en condiciones definidas ajustando las concentraciones de citoquinas.
Esto ayudará a entender los programas de auto-renovación específicos de HSC, mecanismos de resistencia al estrés y propiedades metabólicas, que son difíciles de probar en entornos vivos.
