Apoyado en parte por Vanderbilt CTSA conceder una UL1 RR024975 del Centro Nacional para Recursos de Investigación, Institutos Nacionales de Salud. Este trabajo fue financiado por el NIH R01 HL 83839, R01 IA 65744.

Para el siguiente protocolo, que utilizan las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) en las células de interés. Sin embargo, este protocolo podrá ser utilizado con otros tipos de células. Realizar el ensayo en una campana de cultivo de tejidos utilizando una técnica estéril. Día 1: Preparación de las placas y las células <ol><li> Sacar una placa de ELISPOT y abrirlo en el capó. </li><li> Lavar la placa 3 veces con 150 ml de 1X PBS utilizando una pipeta multicanal, si está disponible, pipeteado y otra solo es aceptable. </li><li> Saca un paquete de depósitos y abrirlo en el capó. </li><li> Añadir 2 mg / mL del anticuerpo de captura anti-humano interferón γ, a 11 mL de PBS 1X. Vortex bien. La transferencia de la mezcla de anticuerpos a un depósito. </li><li> Colocar 100 L de la solución de revestimiento en cada pocillo con el multicanal. </li><li> Envuelva el plato en parafina. </li><li> Colocar la placa en el refrigerador durante la noche. Las placas son buenas para la semana. La regla de oro es que si todavía queda líquido en los pozos, la placa se puede utilizar. </li></ol> Preparación de células Si el PBMCs son frescos y luego contar las células e incubar durante la noche a 37 ° C con 5% de CO 2. Para PBMC almacenados en nitrógeno líquido, el deshielo de las células es necesario. El protocolo es el siguiente: <ol><li> Descongele el criovial de las células a 37 ° C baño de agua hasta que esté casi completamente descongelado. </li><li> Inmediatamente resuspender en 5 ml de los medios de comunicación R10. </li><li> Girar durante 5 minutos a 225 x g. </li><li> Volver a suspender de nuevo en 5 ml de los medios de comunicación R10 y contar las células viables con azul de tripano. </li><li> Llevar a la concentración de 2 x 10 6 células / ml en los medios de comunicación R10. </li><li> Descansar durante la noche a 37 º C con CO2 al 5%. </li></ol> Día 2: Configurar la Plata <ol><li> Etiqueta de la tapa la placa con el número de muestras de identificación, las condiciones del pozo, y la fecha. </li><li> Lavar la placa 6 veces con 150 l de PBS estéril 1x con el vertedero y el método de transferencia. Tenga cuidado de no salpicar la placa durante la descarga. Esto podría provocar que los pozos de la placa de color morado. </li><li> Añadir 100 ml de R20 a cada pocillo. </li><li> Incubar la placa a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Mientras que la placa se está incubando, el recuento de las células que habían descansado durante la noche. </li><li> Haga girar la suspensión de células a 1500 rpm durante 5 minutos. Se decanta el sobrenadante y resuspender el precipitado para que tenga una concentración final de 1x10 6 células por 1 mL en los medios de comunicación R10. </li><li> Después de la incubación de 1 hora, retirar el R20 con el vertedero y el método de transferencia. Tenga cuidado de no salpicar la placa durante la descarga. </li><li> Añadir 100 ml de solución de células (10 5 células) a cada pocillo. Añadir péptidos apropiado y / o los antígenos de los pocillos correspondientes por duplicado. Use una nueva punta cada vez que entra en la solución de péptido de trabajo. Concentración de péptido normal es de 10-40 mg / ml. Desde péptidos varían, cada investigador debe valorar péptidos para obtener resultados óptimos. </li><li> En los pocillos de control negativo, sólo agregar celdas (sin péptidos) </li><li> En los pocillos de control positivo, añadir la fitohemaglutinina (PHA, 10 mg / ml, Sigma). </li><li> Incubar toda la noche a 37 ° C con 5% de CO 2 (~ 18 horas). </li></ol> Día 3: El desarrollo de la Plata <ol><li> Lavar la placa 6 veces con 150 l 1XPBS utilizando el método de descarga y transferencia. </li><li> Añadir 100 ml de PBS en cada pocillo de la placa con la pipeta multicanal. </li><li> Coloque el plato en el refrigerador durante 15 minutos. </li><li> Tome la placa de la nevera y colóquelo en la campana de cultivo de tejidos. </li><li> Prepare la solución de anticuerpos con biotina <ul><li> Añadir 0,5 mg / ml de anticuerpos con biotina (MAB 7-B6-1) a 11ml de PBS. </li><li> Vortex la solución para mezclar bien. </li><li> Si planea agregar la solución con una multicanal, se vierte en un depósito. </li></ul></li><li> Deseche el PBS accionando a la papelera. Tenga cuidado de no salpicar la placa durante la descarga. </li><li> Colocar 100 L de la solución en cada pocillo. </li><li> Se incuba la placa en la capilla de cultivo de tejidos a temperatura ambiente durante una hora. </li><li> Se lava la placa 6 veces con 150μL 1XPBS utilizando el método de descarga y transferencia. En el lavado de 6 º, salir de la PBS en el plato hasta que haya preparado el anticuerpo estreptavidina. </li><li> Prepare el anticuerpo estreptavidina. <ul><li> Añadir 5,5 μ l estreptavidina anticuerpos (estreptavidina-fosfatasa alcalina) de 11ml de PBS (dilución 1:2000). </li><li> Vortex la solución para mezclar bien. </li><li> Si planea agregar la solución con una multicanal, se vierte en un depósito. </li></ul></li><li> Deseche el resto de PBS en los pocillos y secar la placa. </li><li> Añadir 100 ml de la solución de estreptavidina a cada pocillo. </li><li> Se incuba la placa en la capilla de cultivo de tejidos a temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Lavar las placas 6 veces con PBS utilizando el método de descarga y transferencia. En el lavado de 6 º, salir de la PBS en el plato hasta que haya hecho la solución de color. </li><li> Trabajar en la oscuridad. Prepare la solución de sustrato de fosfatasa alcalina (fosfatasa alcalina sustrato Kit IV BCIP / NBT): <ul><li> Añadir 4 gotas de reactivo de sustrato 1 a 11 ml de tampón Tris, vórtice bien. Añadir 4 gotas de reactivo de sustrato de 2 a Tris, vórtice bien. Añadir 4 gotas de reactivo de sustrato de 3 a Tris, vórtice bien. </li></ul></li><li> Deseche el resto de PBS y secar la placa. </li><li> Añadir 100 ml de la solución de color a cada pocillo de la placa con el multicanal. </li><li> Encienda la luz después de 5 a 10 minutos de color en desarrollo. </li><li> Dejar que los reactivos de color de permanecer en el plato hasta que las manchas comienzan a volverse púrpura y son bastante oscuras. Esto debe tomar entre 5 y 20 minutos. Tenga cuidado de no dejar la solución del sustrato en mucho tiempo, ya que hacerlo podría causar ruido de fondo alto. </li><li> Lavar la placa ELISPOT 3 veces con agua del grifo. </li><li> Dejar secar por una hora o toda la noche. </li><li> Lea la placa de forma manual o con lector de placas ELISPOT. </li><li> Guarde la placa en una caja lejos de la luz. </li></ol> Los resultados representativos: ELISPOT está diseñado para cuantificar la respuesta inmune contra los antígenos microbianos. Cada punto indica una célula de respuesta único, que expresa la citoquina de interés. Las manchas pueden ser contados manualmente o con un lector de placas ELISPOT. Evaluación que el ELISPOT se ha realizado correctamente debe comenzar con la investigación del control negativo para la producción de la citoquina de fondo de interés. En los pozos de control negativo se podría esperar para ver sin puntos, aunque un poco de fondo (color morado) pueden estar presentes. Por lo general, no debe ser inferior a un promedio de cinco puntos por cada pozo. El control de los pozos positivos confirman que la reacción se ha realizado correctamente, y que las células responden a la estimulación antigénica. En los pocillos de control positivo que se puede esperar para ver un fondo de color morado oscuro, debido a una confluencia de puntos (Fig. 1). Debe haber poco o ningún fondo blanco. Si el control positivo y las muestras de control negativo son adecuados, uno puede contar con los pozos que contienen el antígeno de interés. A &quot;subóptima&quot; resultado sería reflejada por el fondo de alto (los pozos son de color púrpura), sin manchas o puntos muy pocos, el centro en blanco, puntos mal definidos o manchas confluentes. Una lista de consejos para solucionar problemas es siempre (Tabla 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2221/2221fig1.jpg" /> Figura 1. Un representante de la placa de ELISPOT. Cada plato debe contener un control positivo, control negativo y el péptido de interés llevado a cabo en el mínimo de dos pozos. C9, C10, D9 y D10 son los pocillos de control positivo, como se puede ver que hay un profundo color púrpura, las células confluentes y casi ningún fondo blanco. Los pozos de control negativo son G11, G12, H11 y H12. Estos pozos no tienen fondo morado y sin manchas como se esperaba. Los puntos del G7, el G8, H7 y H8, ilustran las respuestas celulares a péptidos microbianos, los puntos púrpura representan una sola célula que expresa la respuesta de citoquinas de interés. Tabla 1 <table border="1"><tbody><tr><td> Observación </td><td> Problema Posible </td><td> Solución posible </td></tr><tr><td> De fondo de alta </td><td> 1. Ambos lados de la membrana no se lava correctamente 2. Demasiadas células secretoras de citoquinas 3. Placa no se seca correctamente 4. Sobre la placa de desarrollo </td><td> 1. Lave ambos lados de la membrana con agua destilada antes y después del desarrollo del color. Los reactivos pueden filtrarse a través de la membrana en la base de la placa, y estas pueden causar ruido de fondo alto si no se enjuaga. 2. Reducir el número de células por pozo, para ello será necesario la optimización 3. Secar la placa ya antes de leer 4. Reducir el tiempo de desarrollo </td></tr><tr><td> Sin manchas / manchas muy pocos </td><td> 1. No hay suficientes células secretoras de citoquinas / proteína de interés 2. Asegúrese de que las células son estimuladas correctamente 3. Las células no se incubaron durante long suficiente o puede tomar un tiempo para responder a los estimulantes 4. El desarrollo del color inadecuado 5. Anticuerpos no lo suficiente como primarios o secundarios </td><td> 1. Aumentar el número de células. Para ello será necesario la optimización 2. También utiliza un control de estímulos positivos - un estimulante que sabe que inducen la expresión de su citoquinas / proteína de interés 3. Aumentar el tiempo de incubación de células o el uso del método indirecto (pre-tratamiento de las células con estimulantes) 4. Monitorear el desarrollo de color con un microscopio de los gastos generales y garantizar que los reactivos en desarrollo han sido almacenados correctamente y no han perdido la actividad 5. La concentración del anticuerpo primario y / o secundaria será necesario un aumento. Para ello será necesario la optimización. </td></tr><tr><td> Las áreas en blanco </td><td> 1. Membrana no tratados previamente 2. La membrana se ha secado en algún momento 3. Células distribuidas de manera desigual </td><td> 1. Asegúrese de que la membrana está adecuadamente tratados previamente con etanol al 70% (todas las membranas no es necesario esto para que consulte con su proveedor). Lavar bien con PBS 3 veces después 2. Asegúrese de que la membrana no se seca 3. Asegúrese de mezclar las células con cuidado para tener una buena suspensión celulares homólogos antes de pipetear a cabo en los pozos </td></tr><tr><td> Centro de blanco </td><td> 1. Los daños causados ​​por el lavado </td><td> 1. Velocidad de flujo en la lavadora automática (o pipeta) puede ser demasiado alto. Necesidad de un procedimiento de lavado más suave </td></tr><tr><td> Falsos Positivos </td><td> 1. Agregados secundaria de anticuerpos 2. Las células todavía en la membrana 3. La contaminación de células cultura </td><td> 1. Filtro de la secundaria de anticuerpos 2. Asegúrese de que todos se lavan las células de la membrana con PBS Tween 20 antes de la incubación del anticuerpo secundario. Las células de la izquierda en la membrana se dan en forma de manchas irregulares 3. Mantenga los reactivos como estéril y limpia como sea posible. Asegúrese de que su técnica de cultivo celular es aséptico. Compruebe que los falsos positivos mediante la ejecución de un control de los medios de comunicación negativa. De movimiento de las placas, <a href="http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&amp;rid=11457#7">ver los puntos mal definidos</a> </td></tr><tr><td> Las manchas confluentes </td><td> 1. Revestimiento de los pobres, los anticuerpos demasiado 2. Cultivo celular prolongada 3. Células sobre-estimulado </td><td> 1. Reducir la concentración del anticuerpo primario 2. Cuanto más tiempo se incuban las células, más citoquinas / proteínas que se secretan. Esto se traducirá en grandes manchas que comienzan a fusionarse y se vuelven indistinguibles. 3. Reducir el cultivo de células de paso el tiempo de incubación. La sobre-estimulación se traducirá en una gran cantidad de citoquinas / proteína secretada por la célula. Esto producirá manchas que comienzan a fusionarse y se vuelven indistinguibles. Reducir la cantidad de estimulantes en los medios de cultivo o de la cultura para un corto período de tiempo </td></tr><tr><td> Puntos mal definidos </td><td> 1. Membrana no tratados previamente (si la membrana requiere de esto, consulte con el proveedor) 2. Placa de movimiento durante la incubación de células </td><td> 1. La membrana debe ser pre-tratados con etanol o esto puede resultar en manchas difusas, mal definidas. Será difícil para el lector para distinguir estos 2. No permita que la placa se mueva durante la incubación de células como las células que se han movido a crear más de un punto. Si es posible utilizar una incubadora dedicada que no se abran durante la incubación. No toque la placa después de la adición de las células </td></tr><tr><td> Positivos de control de los pozos es baja </td><td> 1. Subdesarrollo - puede ser un resultado del uso de estreptavidina-fosfatasa alcalina y / o soluciones BCIP / NBT que no han sido llevados a la temperatura ambiente </td><td> 1. Llevar los reactivos a temperatura ambiente antes de añadir a los pozos </td></tr><tr><td> La densidad de los puntos hace que sea difícil cuantificarlos </td><td> 1. Muchas células se han añadido a los pozos </td><td> 1. Hacer diluciones de las células (es decir, 1 x 10 6, 5 x 10 5, 1 x 10 5, 5 x 10 4, 1 x 10 4 células por pozo) para determinar el número óptimo de las células que darán lugar a la formación de manchas de distintos </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+diagnostic+evaluation+of+suspected+tuberculosis.">Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis.</a> Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).</li><li>Sung, H. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+abdominal+tuberculosis+by+T-cell+based+assays+on+peripheral+blood+and+peritoneal+fluid+mononuclear+cells.">Diagnosis of abdominal tuberculosis by T-cell based assays on peripheral blood and peritoneal fluid mononuclear cells.</a> Journal of Infection. 59, 409-415 (2009).</li><li>Kim, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+Central+Nervous+System+Tuberculosis+by+T-Cell-Based+Assays+on+Peripheral+Blood+and+Cerebrospinal+Fluid+Mononuclear+Cells.">Diagnosis of Central Nervous System Tuberculosis by T-Cell-Based Assays on Peripheral Blood and Cerebrospinal Fluid Mononuclear Cells.</a> Clinical and Vaccine Immunology. , 1356-1362 (2008).</li><li>Drake, W. P., Dhason, M. S., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Vadivelu, S., Hajizadeh, R., Newman, L. S., Kalams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+recognition+of+Mycobacterium+tuberculosis+ESAT-6+and+KatG+peptides+in+systemic+sarcoidosis.">Cellular recognition of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and KatG peptides in systemic sarcoidosis.</a> Infect Immun. 75, 527-530 (2007).</li><li>Allen, S. S., Evans, W., Carlisle, J., Hajizadeh, R., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Pride, D. T., Johnson, J. E., Drake, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+dismutase+A+antigens+derived+from+molecular+analysis+of+sarcoidosis+granulomas+elicit+systemic+Th-1+immune+responses.">Superoxide dismutase A antigens derived from molecular analysis of sarcoidosis granulomas elicit systemic Th-1 immune responses.</a> Respir Res. 25, 36-36 (2008).</li><li>Mutsvangwa, J., Millington, K. A., Chaka, K., Mavhudzi, T., Cheung, Y. B., Mason, P. R., Butterworth, A. E., Corbett, E. L., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+recent+Mycobacterium+tuberculosis+transmission+in+the+setting+of+high+HIV+and+TB+burden.">Identifying recent Mycobacterium tuberculosis transmission in the setting of high HIV and TB burden.</a> Thorax. 65, 315-320 (2010).</li><li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research.">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat Protoc. 4, 461-469 (2009).</li><li>Chaudhary, N., Staab, J. F., Marr, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+human+T-Cell+Responses+to+Aspergillus+fumigatus+antigens.">Healthy human T-Cell Responses to Aspergillus fumigatus antigens.</a> PLoS One. 5, e9036-e9036 (2010).</li><li>Manigold, T., Mori, A., Graumann, R., Llop, E., Simon, V., Ferr, S. M., Valdivieso, F., Castillo, C., Hjelle, B., Vial, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+differentiated,+resting+gn-specific+memory+CD8++T+cells+persist+years+after+infection+by+andes+hantavirus.">Highly differentiated, resting gn-specific memory CD8+ T cells persist years after infection by andes hantavirus.</a> PLoS Pathog. 6, e1000779-e1000779 (2010).</li><li>Ndongala, M. L., Kamya, P., Boulet, S., Peretz, Y., Rouleau, D., Tremblay, C., Leblanc, R., C&#244;t&#233;, P., Baril, J. G., Thomas, R., V&#233;zina, S., Boulassel, M. R., Routy, J. P., S&#233;kaly, R. P., Bernard, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+function+of+HIV-specific+T-cell+responses+with+increasing+time+from+infection.">Changes in function of HIV-specific T-cell responses with increasing time from infection.</a> Viral Immunol. 2, 159-168 (2010).</li></ol>

El ensayo de ELISPOT se ha convertido en uno de los ensayos más importantes y ampliamente utilizado para controlar las respuestas inmunitarias en el ser humano y una variedad de otras especies. Con el ensayo de ELISPOT, las frecuencias de las células inmunitarias se puede medir a nivel celular individual sin la expansión o la manipulación de las poblaciones de células. ELISPOT se ha aplicado ampliamente para investigar antígeno de respuestas inmunes específicas en varias enfermedades, incluyendo infecciones, cán...

A. Preparación de los medios de comunicación <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsA.jpg" alt="A los materiales" /> B. Preparación de Tris Buffer <ol><li> Añadir 800 ml de ddH2O de vaso de 1 litro. </li><li> Medida 12 gramos de Tris y añadir a la jarra. </li><li> Añadir 0,12 gramos de cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl 2: 6H 2 O) en el vaso. </li><li> Remover con la varilla de agitación magnética en la placa de agitación automática. </li><li> Una vez disuelto, el pH de la solución a 9,5. </li><li> Añadir 200 ml de ddH2O al vaso, con lo que hasta 1000 ml. </li><li> Filtrar la solución con un filtro de 0,22 micras. </li></ol> C. necesarios para el análisis ELISPOT Materiales: <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsb.jpg" alt="Materiales B" />

enzyme-linked immunospot assay (elispot):  quantification of th-1 cellular immune responses against microbial antigens

La inmunidad adaptativa es un componente importante a la limpieza de patógenos intracelulares. La capacidad para detectar y cuantificar estas respuestas en los seres humanos es una herramienta diagnóstica importante. El ensayo de la enzima-inmunoensayo (ELISPOT) está ganando popularidad por su capacidad para identificar la respuesta inmune celular contra antígenos microbianos, incluyendo las poblaciones inmunodeprimidas como las infectadas por el VIH, el trasplante, y el uso de esteroides. Este ensayo tiene la capacidad de cuantificar la respuesta inmune contra antígenos microbianos específicos, así como distinguir si estas respuestas son Th1 o Th2 en el carácter. ELISPOT no se limita a la zona de la inflamación. Es versátil en su capacidad para evaluar la respuesta inmune en la sangre periférica, así como los sitios de participación activa, como lavado broncoalveolar, líquido cefalorraquídeo, y ascitis. La detección de la respuesta inmune contra un antígeno único o múltiple es posible, así como epítopos específicos dentro de las proteínas microbianas. Este ensayo permite la detección de la respuesta inmune con el tiempo, así como las diferencias en los antígenos reconocidos por las células T de acogida. Doble ELISPOT color están disponibles para la detección de la expresión simultánea de dos citoquinas. Las recientes aplicaciones de esta técnica incluyen el diagnóstico de tuberculosis extrapulmonar, así como la investigación de la contribución de los antígenos infecciosas a las enfermedades autoinmunes.

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Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identificación de objetivos microbiana de la inmunidad adaptativa en las enfermedades idiopáticas se puede lograr mediante el uso de la prueba de inmunoensayo enzimático.

Enzima-inmunoensayo de ensayo (ELISPOT): La cuantificación de la Th-1 respuesta inmune celular contra antígenos microbianos

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

34.6K vistas.  Vanderbilt University School of Medicine. Identificación de objetivos microbiana de la inmunidad adaptativa en las enfermedades idiopáticas se puede lograr mediante el uso de la prueba de inmunoensayo enzimático.

Video: Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

El uso de interferón-γ enzimo-inmunoensayo para la Caracterización de Nuevos epítopos de células T del virus del papiloma humano

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Investigación

Inmunología e Infección

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

Aplicación de Ensayo inmunoensayo de largo plazo culta Interferón-γ ligado a enzimas para la evaluación efectoras y de memoria T respuestas celulares en el ganado

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

La medición de la influenza neuraminidasa inhibición títulos de anticuerpos mediante un ensayo de lectina ligado a enzimas

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Desarrollo y validación de una sola molécula ultrasensible matriz Digital análisis de enzima-ligado del inmunosorbente para interferón-α humano

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

Optimizado de interferón-gamma ELISpot análisis a las respuestas de la célula de T de medida en el modelo de conejillo de Indias después de la vacunación

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonofagocítico asesinato ensayo para evaluar las respuestas inmunológicas contra patógenos bacterianos

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to assess the respiratory immune/inflammatory response to this bacterium. Flow cytometry and confocal microscopy are fluorescence-based technologies that allow detailed characterization of biological responses.&#160;Different forms of Hi antigen can be used, including cell wall components, killed/inactivated preparations, and live bacteria. Hi is a fastidious bacterium that requires enriched media but is generally easy to grow in standard laboratory settings. Tissue samples for stimulation with Hi may be obtained from peripheral blood, bronchoscopy, or resected lung (e.g., in patients undergoing surgery for the treatment of lung cancer). Macrophage and neutrophil function may be comprehensively assessed using flow cytometry with a variety of parameters measured, including phagocytosis, reactive oxygen species, and intracellular cytokine production. Lymphocyte function (e.g., T cell and NK cell function) may be specifically assessed using flow cytometry, principally for intracellular cytokine production. Hi infection is a potent inducer of extracellular trap production, both by neutrophils (NETs) and macrophages (METs). Confocal microscopy is arguably the most optimal way to assess NET and MET expression, which may also be used to assess protease activity. Lung immunity to Haemophilus influenzae can be assessed using flow cytometry and confocal microscopy.

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae induces inflammation in the respiratory tract. This article will focus on the use of flow cytometry and confocal microscopy to define immune responses by phagocytes and lymphocytes in response to this bacterium.

Evaluación de las respuestas inmunitarias respiratorias a Haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...