En el pasado, la caracterización de la inmunoterapia en el modelo de conejillo de indias se limitaba a medir la inmunidad humoral. El ensayo ELISpot supera esa limitación y ayudará a los investigadores a generar datos más significativos en ese modelo animal. La principal ventaja de esta técnica es que las células se obtienen de la sangre periférica.
No se requiere necropsa. Esto permite la medición no sólo de la magnitud, sino también de la cinética de las respuestas de las células T en conejillos de indias individuales durante una infección natural o a lo largo de un régimen vacunal. Demostrar el procedimiento estará Holly Pugh.
Es investigadora del Departamento Preclínico de Irán y D de Inovio. Para comenzar añadir 15 microlitros de 35% etanol a cada pozo de una placa de ensayo ELISpot. Después de 60 segundos añadir 150 microlitros de PBS a cada pozo.
E invertir la placa para detener el pretratamiento del etanol. También se debe tener mucho cuidado al manipular las placas de ensayo ELISpot para evitar la contaminación o dañar la membrana. Para lavar la placa añadir 250 microlitros de PBS a cada pozo.
Después de repetir el lavado dos veces más, agregue 100 microlitros de anticuerpo gamma de interferón de conejillo anti-guinea de captura VE4 a cada pocillo. A continuación, incubar la placa durante al menos 12 horas a 4 grados centígrados. Después del período de incubación, lave las placas tres veces.
Agregue 200 microlitros de búfer de bloqueo a cada pozo. Incubar la placa a temperatura ambiente durante dos horas. A continuación, lave las placas tres veces más.
Preparar tubos cónicos con 4,5 ml de gradiente de densidad de temperatura ambiente. Luego mezcle un volumen igual de Hanks'Balanced Salt Solution con la sangre. Capa de la sangre diluida gradualmente sobre el medio de gradiente de densidad, teniendo cuidado de no molestar a la interfaz.
Después de esto, centrifugar los tubos a 800 x g durante 30 minutos sin frenos a temperatura ambiente. Retire el tubo de la centrífuga, teniendo cuidado de no perturbar las capas. Después de identificar correctamente las capas aspirar la capa completa de capa buffy para cosechar los PBMC.
Capa lenta de la sangre diluida HBSS en el medio de gradiente de densidad. Evite cualquier perturbación del tubo y apague los frenos de la centrífuga. Transfiera las células a un nuevo tubo de 15 ml.
Luego diluir las células en medio R10 a un volumen total de 15 ml. Después de peletizar las células, desechar el sobrenadante y resuspender las células en 15 ml de medio R10. Pase la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micrómetros en un tubo nuevo.
Cuente las celdas y determine el número de celdas vivas con la prueba de exclusión azul de Trypan. A continuación, diluya las células con el medio R10. Primero retire el tampón de bloqueo y lave las placas.
Para cada muestra de PBMC indicar triplicados del control positivo, control negativo, y cada estimulante específico del experimento. Diluir la piscina de péptidos proteicos en medio R10 medio a tres veces la concentración final deseada. Después de esto añadir 50 microlitros de la mezcla media péptido R10 a los pozos de prueba estimulantes de la placa.
A continuación, añadir 50 microlitros de formulación de péptido MT en el medio R10 a los pozos de control negativo de la placa. Añadir ConA en el medio R10 a los pozos de control positivos de la placa, a continuación, añadir 100 microlitros de la suspensión PBMC a todos los pozos. Coloque la placa ELISpot sobre una superficie uniforme en la incubadora y evite perturbar la placa durante el período de incubación.
Después de retirar cuidadosamente la placa de la incubadora, invierta la placa para retirar el sobrenadante. A continuación, lave el plato tres veces. Añadir 100 microlitros de detección biotinilada diluida capturan anticuerpos gamma de interferón anti-guinea enzancia N-G3 a cada pocillo.
A continuación, incubar la placa a temperatura ambiente durante dos horas. Invierta la placa para extraer la solución de anticuerpos y repita el lavado tres veces. Después de retirar el PBS de la placa, agregue 100 microlitros de estreptavidina conjugada ALP diluidos en tampón de bloqueo a cada pozo.
A continuación, incubar la placa a temperatura ambiente durante una hora. Invierta la placa para desechar la solución de estreptavidina ALP y lave la placa dos veces. Invierta la placa y sobra contra una toalla de papel limpia para eliminar cualquier exceso de PBS.
Después de esto lavar la placa con 250 microlitros de agua Ultrapure DI por pozo. Invierta la placa y retire el exceso de agua con una toalla de papel limpia. A continuación añadir 100 microlitros de solución de sustrato BCIP/NBT a cada pozo.
Incubar la placa a temperatura ambiente durante 20 minutos protegida de la luz. Enjuague la placa cuatro veces con agua DI. A continuación, invierta y toque la placa para eliminar el exceso de agua.
Finalmente, retire el drenaje plástico de la parte inferior de la placa y deje que la membrana se seque por completo. Después de la centrifugación de gradiente de densidad exitosa como se demostró anteriormente, el líquido viscoso rojo en la parte inferior del tubo debe contener la mayoría de los glóbulos rojos. La capa de capa de color superior está entre la capa de plasma y el medio de gradiente de densidad.
Antes de añadir el anticuerpo de captura, el ensayo mostró una definición mejorada junto con una reducción en el número de puntos inespecíficos en los pozos de control negativos. Las manchas son indicativas de la producción de interferón gamma que produce células T dentro de la población de PBMC. Al intentar esta técnica, es importante recordar procesar cuidadosamente pero rápidamente la sangre.
Esto mejorará la viabilidad celular, mejorará la formación de manchas y reducirá la formación de manchas inespecíficas. No olvide que trabajar con sangre y sustrato de BCIP/NBT puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de EPI adecuado durante la realización de este procedimiento. Creo que este protocolo permite a los investigadores estudiar enfermedades con un componente de células T importante como la tuberculosis, el ébola y el VHS.
Es importante destacar que perfeccionará el desarrollo de protocolos de vacunas en el modelo de conejillo de indias y reducirá el uso de modelos animales menos relevantes.
